Tài liệu Cong nghe len men san xuat sinh khoi vi

I. NGUYÊN LIỆU LÀM MÔI TRƯỜNG VI SINH VẬT: 1. Vi khuẩn lactic 1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae. Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc tạo chuỗi, thuộc vi khuẩn gram dƣơng (+). Vi khuẩn lactic không di động. Vi khuẩn lactic không tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay ngƣời ta tìm thấy một số giống trong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử). Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn kị khí chịu dƣỡng. Vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzyme catalase. Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng phân giải H2 O2 để tạo ra nƣớc và O 2 để phát triển. 1.2. Sự phân bố: Ít gặp trong đất và nƣớc,thƣờng phát triển trong những môi trƣờng có chứa nhiều chất hữu cơ phức tạp nhƣ: - Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thƣờng gặp Lactobacillus lactic, Lactobacillus bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus ferment,Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trƣờng sữa vi khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose. - Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus lactis...Chúng còn đƣợc tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây. - Trong ruột và các niêm dịch ở ngƣời và động vật có Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus. 1.3. Phân loại vi khuẩn lactic Dựa vào quá trình lên men đƣờng: có 2 loại - Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85-95% acid lactic. Do thiếu porphyrin và cytochrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lƣợng bằng con đƣờng lên men bắt buộc. Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase và triosophotphatizomerase. - Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% ac id lactic, 25% cồn và 25% acid acetic. Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh hƣơng Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus diactylactis,...và Lactobacillus brevis,Lactobacillus fermenti,... Bảng 1 : Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính Chi và dƣới chi Kiểu lên men Streptococcus Pediococcus Lactobacillus Thermobacterium Streptobacterium Betabacterium Đồng hình Đồng hình Đồng hình Đồng hình Dị hình (tùy tiện) Dị hình Leuconostoc Dị hình bifidobacterium Dị hình Sản phẩm chính (Tỷ lệ phân tử) lactat lactat lactat lactat Lactat : axetat 1 :1 Lactat : axetat : CO 2 1 :1 : 1 Lactat : axetat : CO 2 1 :1 : 1 Lactat : axetat 2 :3 Cấu hình của acid lactic L (+) DL và L (+) D (-),L (+), DL D (-),L (+), DL DL D (-) L (+) Dựa vào hình thái: có 2 loại - Cầu khuẩn lactic: Streptococcus - Trực khuẩn lactic: Lactobacillus Dựa vào tính mẫn cảm với oxi: có 3 nhóm - Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt - Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae - Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện): Dựa vào nhiệt độ phát triển tối ƣu: có 2 nhóm - Vi khuẩn lactic ƣa ấm: 25-35 C Ví dụ: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L. plantarum,… - Vi khuẩn lactic ƣa nhiệt: 37-45 C Ví dụ: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L. helvetcus,… 2. SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC 2.1. Mục đích thu nhận sinh khối vi khuẩn lactic Trong thời gian trƣớc đây mỗi cơ sở sản xuất có phƣơng pháp và qui trình riêng để nhân giống và bảo quản giống dùng cho sản xuất. Khi cần sử dụng ngƣời ta sẽ tiến hành nhân giống qua nhiều giai đoạn theo nguyên tắc thu nhận một canh trƣờng vi sinh vật thuần khiết. Hiện nay một số nhà máy chế biến thực phẩm và những nhà máy sản xuất các sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh vật vẫn đang sử dụng phƣơng pháp này nên giống vi sinh vật đƣợc xem là độc quyền sở hữu của mỗi nhà máy. Từ những năm 1980, trên thế giới phát triển mạnh một ngành công nghiệp mới, công nghiệp sản xuất và cung cấp giống vi sinh vật. Các chế phẩm giố ng thƣơng mại bao gồm đủ loại: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi… Vi khuẩn lactic cũng không ngoại lệ, sinh khối vi khuẩn lactic đƣợc thu nhận, bảo quản và cung ứng cho ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa. Chế phẩm giống thƣơng mại có thể cấy trực tiếp vào môi trƣờng lên men hoặc hoạt hoá chúng trên một môi trƣờng dinh dƣỡng trong một khoảng thời gian nhất định trƣớc khi cấy. 2.2. Các loài vi khuẩn lactic dùng trong công nghiệp sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Quan trọng là sinh khối của vi khuẩn lactic lên men đồng hình. Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Streptococus lactic Streptococcus cremoris Lactobacillus acidophilus Nhóm vi khuẩn sinh hƣơng a/ Lactobacillus acidophilus Hình 1: Lactobacillus acidophilus  Thuộc trực khuẩn, có kích thƣớc : rộng 0.6-0.9 µm, dài 1.5-6 µm.  Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn, thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng (+) và có khả năng chuyển động.  Chúng có khả năng lên men một loạt đƣờng nhƣ : glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo acid lactic.  Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inocitol.  Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học của acid lactic.  Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 45 C, pH 4-5. b/ Lactobacillus bulgaricus Hình 2: Lactobacillus bulgaricus  Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram (+).  Chúng không có khả năng di chuyển.  Có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng glucose, lactose, galactose.  Không lên men đƣợc xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, ma nnitol, dextrin, inulin.  Chúng không có khả năng tạo initrit từ nitrate.  Nhiệt độ phát triển 40-50 C, pH thích hợp 5.5-6.0. c/ Streptococcus thermophilus Hình 3: Streptococcus thermophilus  Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đƣờng kính 0.7-0.9 µm, không chuyển động, thƣờng kết thành chuỗi ngắn, gram (+).  Phát triển tốt ở 40-45 C, pH 5.8-6.0. Không phát triển đƣợc ở 53 C và dƣới 20 C, sống đƣợc ở 65 C trong 30 phút.  Không phát triển đƣợc trong môi trƣờng sữa chứa 0.01% methylen blue, môi trƣờng máu chứa 10% mật.  Có khả năng lên men glucose, fructose,lactose, saccharose.  Nhạy cảm với các chất kháng sinh 0.01 µg/ml tetracycline hay 0.1µg/ml chloremphen. d/ Streptococcus cremoris Hình 4: Streptococcus cremoris      Cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tạo thành từng chuỗi rất dài, gram (+). Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 30 C. Chúng không phát triển đƣợc ở nồng độ NaCl 4%. Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, CO 2 , diacetyl. Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn e/ Streptococcus lactic Hình 5: Streptococcus lactic  Thuộc chuỗi cầu khuẩn, gram (+).  Nhiệt độ phát triển 10-45 C, tối thich ở 30-35 C.  Có khả năng chịu đƣợc nồng độ NaCl 4%.  Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, mannitol, salicin tạo ra acid lactic, CO 2 , acid acetic, diacetyl. Chúng không có khả năng lên men đƣợc raffinose, insulin, glycerol, sorbitol 2.3. Giống vi sinh vật dùng cho sản xuất Giống vi sinh vật là một trong bốn yếu tố quyết định năng suất sản xuất sản xuất công nghiệp vi sinh vật. Cùng với chất lƣợng môi trƣờng, điều kiện lên men, các phƣơng pháp thu nhận và tinh chế sản phẩm,giống vi sinh vật là khâu đầu tiên can phải quan tâm đặc biệt. Giống vi khuẩn lactic dùng cho sản xuất phải đáp ứng các yêu cầu sau:  Giống có khả năng thích ứng nhanh, phát triển mạnh  Giống có khả năng sinh sản cao.  Giống có khả năng chống lại đƣợc đối với các điều kiện bất lợi.  Giống dễ dàng tách khỏi môi trƣờng nuôi cấy  Khả năng dễ bảo quản và bảo tồn đƣợc đặc tính di truyền trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng.  Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao 3. MẬT RỈ: Mật rỉ là thứ liệu trong công nghệ sản xuất đƣờng từ cây mía hay củ cải đƣờng. Trƣớc đây mật rỉ ít đƣợc sử dụng trong công nghệ vi sinh. Sau này ngƣời ta thấy mậy rỉ có rất nhiều ƣu điểm để tạo môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Những đặc tính quan trọng phù hợp với qua trình lên men của mật rỉ bao gồm : - Chứa hàm lƣợng đƣờng cao. - Ngoài đƣờng saccharose còn chứa rất nhiều chất hƣu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trƣởng - Tuy nhiên rỉ đƣờng cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men. Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải có các quá trình sử lý thích hợp. Các đặc diểm cần lƣu ý ở mật rỉ bao gồm: Rỉ đƣờng có màu nâu sẫm. Màu này khó bị phá hủy trong quá trình lên men. Sau lên men chúng bám vào sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thƣờng rất tốn kém và rất khó khăn. Hàm lƣợng đƣờng khá cao (thƣờng nằm trong khoảng 40-50%). Lƣợng này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng với nồng độ thích hợp. Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong mật rỉ. Keo càng nhiều, khả năng hòa tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng kém. Do đó công việc quan trọng của nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phá hệ keo này. Vì rỉ đƣờng là chất dinh dƣỡng khá lý tƣởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và phát triển. Nhƣ vậy chất lƣợng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời gian bảo quản Thành phần hóa học: Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau: - Nƣớc chiếm 15-20%, chất khô chiếm 80-85%. - Trong đó, có 60% là đƣờng ( 40% là đƣờng saccharose, 20% là fructose và glucose và 40% chất còn lại là chất phi đƣờng ) - Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30-32% hợp chát hữu cơ và 6-105 hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ có: K2O: 3,5% Fe2 O3 : 0,2% MgO: 0,1% Sulfat: 1,6% CaO: 1,5% SiO 2 : 0,5% P2 O5 : 0,2% Clorit: 0,4% - Trong những hợp chất hữu cơ gồm có các hợp chất chứ nitơ và không chứ nitơ ở dạng amin nhƣ: acid aspactic, acid glutamic, leuin, izoleuxin. Nito tổng số chiếm khoảng 0,3-0,5% ( ít hơn so với so với lƣợng nitơ có trong rỉ đƣờng củ cải) Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Bảng 2: Thành phần các chất trong rỉ đường Các chất thành phần Hàm lượng % trong rỉ đường Saccharose 32 Chất hữu cơ phi đƣờng 10 Chất tro 8 Trong đó: K 2 O 3.5 CaO 1.5 MgO 0.1 SiO2 0.5 SO3 1.6 Cl2 0.4 Na2 O + Fe2O3 + Al2 O3 0.2 P2 O5 0.2 N tổng 5-2.2 N-amin 0.2-0.5 CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 7 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Bảng 3: Thành phần vitamin trong rỉ đường mía Vitamin Hàm lượng (mg%) Thiamin 0.5 Riboflavin 0.12 Pyridoxin 0.9 Nicotinamit 1.5 Acid pantotenic 7.0 Acid foleic 0.02 Biotin 0.15 Inozit 500.0 Các chất màu của rỉ đường mía bao gồm: - Caramel: xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân saccharose kèm theo loại trừ nƣớc và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. - Phức chất polyphenol-Fe2+: có màu vàng xanh, không bị loại hết trong giai đoạn làm sạch và tồn tại trong mật rỉ - Melanodin: đây là sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng khử và acid amin mà chủ yếu là acid aspartic. Sản phẩm ngƣng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đƣờng. - Melanin: đƣợc hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acidamin thơm nhờ xúc tác của enzym polyphenol oxydaza khi có mặt của oxy và Cu+2 . - Các acid amin thơm thƣờng bị oxy hóa là tiroxin và brenzcatechin. Các melanin thƣờng bị loại hết ở giai đoạn làm sạch nƣớc đƣờng nên chỉ tìm thấy một lƣợng rất nhỏ trong rỉ đƣờng. - Chất keo: đƣợc hình thành bởi potein và pectin. Các chất này ảnh hƣởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào, ngăn cản CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 8 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic quá trình hấp thụ các chất dinh dƣỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài. Ngoài ra keo là nguyên nhân chính tạo ra một lƣợng bọt lớn trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. Vi sinh vật trong rỉ đường mía. Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đƣờng mía . Đa số chúng có từ nguyên liệu, một số nhỏ từ không khí, nƣớc, đất vào dịch đƣờng. Loại nào chịu đƣợc tác dụng nhiệt hay tác dụng của hoá chất thì tồn tại. Ngƣời ta chia rỉ đƣờng thành 3 loại tuỳ theo số lƣợng vi sinh vật tạp nhiễm. Bảng 4: Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm. Loại rỉ đƣờng I II Số lƣợng VSV trong 1g đƣờng 100000 100000- 1000000 III 1000000- 5000000 CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Đánh giá và xử lý Rất tốt, không cần xử lý Trung binh, cần thanh trùng Nhiễm nặng cần xử lý nghiêm ngặt Trang 9 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic II. QUI TRÌNH THU NHẬN SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC Mật rỉ Xử lý Chuẩn bị Môi trƣờng Giống VSV Thanh trùng Nhân giống Nuôi cấy Sấy thăng hoa Ly tâm Đóng gói Sản phẩm CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 10 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic III. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: 1. Xử lý mật rỉ: 1.1 Pha loãng sơ bộ: a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình acid hóa. b. Biến đổi: Hóa học: giảm nồng độ chất khô. Vật lý: giảm độ nhớt. Hoá lý: tăng độ hoà tan các chất. c. Thực hiện: Pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ Vmật rỉ : Vnƣớc = 1 : 3 1.2 Xử lý dịch pha loãng: Truớc tiên, ta phải tẩy màu và tách các keo có trong mật rỉ 1.2.1. Acid hoá: a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật b. Biến đổi: Hóa học: đƣờng saccharose chuyển thành glucose và fructose dƣới sự xúc tác của acid; pH giảm về 2.8-3.0 Hóa lý: hệ keo bị phá vỡ Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt do nhiệt độ cao và pH thấp. c. Thực hiện: Lƣợng acid sunfuric đậm đặc thêm vào là 5% khối lƣợng dung dịch. Trong giai đoạn này, ta đun dung dịch đến 90-95o C trong 6 giờ. Sau đó ta tiến hành ly tâm thu dịch trong. d. Thiết bị và thông số công nghệ: - Nồi phản ứng . CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 11 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic 1- Ống nối để nạp chất tải nhiệt; 2- Ống chảy tràn sản phẩm; 3- Ống quá áp; 4- Đầu nối ống nạp nguyên liệu; 5- Cửa quan sát; 6- Cửa thoát chất tải nhiệt; 7- Cửa vào của chất tải nhiệt; 8- Cửa ra của sản phẩm; 9- Cửa thoát chất tải nhiệt Hình 6:Nồi phản ứng dạng đứng Nồi phản ứng bằng thép hay bằng gang tráng men dùng để tiến hành các quá trình hoá - lý khác nhau. Nồi phản ứng - máy trộn là một thiết bị dạng xilanh đứng có thể tích từ 0,1 ÷ 100 3 m hoặc hơn, có áo hơi.Bên trong thiết bị có cơ cấu đảo trộn dạng tuabin hở. Khi sử dụng các thiết bị có áo hơi dạng bán ống thì áp suất làm việc cho phép đến 1,6 MPa, còn trong áo hàn phẳng không nhỏ hơn 0,4 MPa. Nƣớc máy hay nƣớc tuần hoàn, nƣớc muối, hơi nƣớc bảo hoà hay chất tải nhiệt hữu cơ có nhiệt độ cao có thể cho vào áo hay vào ruột xoắn. CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 12 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Nồi phản ứng - máy trộn có thể tháo rời hay hàn cố định với các bộ phận đáy elip và nắp. Trên thiết bị có các khớp nối để nạp các chất tải nhiệt, chảy tràn sản phẩm, để nối ống quá áp, nối khớp đầu ống nguyên liệu, khảo sát chất liệu, các khớp nối để nạp và thải chất tải nhiệt và sản phẩm, van an toàn, nhiệt kế. Sau khi nạp vào thiết bị một lƣợng nƣớc nhất định.Tiến hành đun nóng môi trƣờng đến một nhiệt độ đã cho bằng phƣơng tiện điều chỉnh tự động. Tần số trộn của máy khuấy 0,2 ÷ 0,33 vòng/s, phụ thuộc vào dạng cơ cấu trộn và các tính chất của các cấu tử đem trộn. Khi thiết kế máy trộn dạng tuabin, số vòng quay 3 ÷ 3,3 vòng/s, dạng khung 0,33 ÷ 1 vòng /s. Dẫn động máy trộn đƣợc thực hiện nhờ động cơ điện qua hộp giảm tốc. 1.2.2. Ly tâm thu dịch trong: a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men b. Biến đổi: Hóa học: tạp chất bị loại bỏ, giữ lại chất hòa tan Hóa lý: tách pha rắn khỏi pha lỏng Vật lý: tăng độ trong, giảm khối lƣợng riêng dung dịch c. Thiết bị và thông số công nghệ: Hình 7:Thiết bị ly tâm lọc CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 13 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Thiết bị ly tâm lọc hoạt động theo nguyên tắc: khi hệ thống quay với tốc độ cao tạo ra lực ly tâm mạnh và đẩy các thành phần pha lỏng và rắn ra sát thành thiết bị nhƣ hình vẽ, thành thiết bị có gắn vải lọc để các cấu tử chất hoà tan đi qua và giữ lại c ác thành phần pha rắn. 2. Chuẩn bị môi truờng: Khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy, ta phải chú ý những đặc điểm sau đây: Các nguyên vật liệu làm môi trƣờng nhất thiết phải cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng cho các quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật, đồng thời duy trì đƣợc thế oxy hóa–khử, áp suất thẩm thấu và tạo đƣợc sự ổn định của pH thích hợp của môi trƣờng. Thành phần nguyên vật liệu phải đƣợc cân đo chính xác và pha chế theo đúng trình tự hƣớng dẫn. 2.1.Nhu cầu dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dƣỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trƣờng đơn giản chỉ chứa glucose và NH 4 + mà chúng đòi hỏi hàng loạt các vitamin nhƣ lactoflamin, thiamin, acid pantothenic, a cid nicotinic, acid folic, biotin... và các acid amin. Vì thế ngƣời ta thƣờng nuôi cấy chúng trên một môi trƣờng phức tạp chứa một lƣợng tƣơng đối cao nấm men, cao thịt và nƣớc chiết cà chua. 2.1.1. Nhu cầu dinh dƣỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc rất nhiều các loại carbonhydrate khác nhau từ glucose, fructose, maltose đến saccharose... Các nguồn cacbon này dùng để cung cấp năng lƣợng tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào. Vì vậy đây là nguồn thức ăn cacbon có ý nghĩa quan trọng nhất đối với sự sống của tế bào vi sinh vật. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các acid amin nhƣ acid glutamic, arginine hay tyrozyne làm nguồn cung cấp năng lƣợng. Khi đó diễn ra quá trình decacboxyl và tạo CO 2 . Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đƣờng có tính khử ở liều lƣợng nhỏ. Nếu khi nhân giống ngƣời ta dùng một loại đƣờng thông thƣờng hiếm khi đƣợc dùng làm nguồn cacbon thì khi đƣa vào sản xuất vi khuẩn có thể phát triển hiệu quả trên chứa loại đƣờng này mà không làm ảnh hƣởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon thông thƣờng. 2.1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng nitơ: Nguồn nittơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH3 ,NH4 +.Sau khi đồng hóa gốc NH4 + trong môi trƣờng sẽ tích lũy các anion vô cơ (SO 4 2-,HPO42-,Cl-…) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng,ta phải điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi cấy. CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 14 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Đa số vi khuẩn không có khả năng sinh tổng hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ từ nguồn dinh dƣỡng vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo cho sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải dùng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng dƣới dạng các acid amin. Tuy nhiên để vi khuẩn phát triển bình thƣờng thì ngoài nguồn nitơ của acid amin thì vi khuẩn lactic còn cần những chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nhƣ cao thịt, cao nấm men, peptone, cazein... 2.1.3. Nhu cầu về vitamin: Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển của mình và các vitamin này đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của chúng. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ riboflavin, thiamin, acid pantothenic, nicotinic, biotin.. Nhu cầu vitamin chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, pH, nồng độ CO 2 ban đầu, thế oxy hoá khử và thành phần của môi trƣờng. Bảng 5: Vitamin và các chất sinh truởng cần thiết cho sự sinh truởng của các vi khuẩn lactic Chất Acid p-aminobenzoic Acid folic Acid 5- focmyl-5,6,7,8-tetrahidrofolic Locovorin Acid nicotinic Riboflavin Acid pantothenic Panteterin.pantetin Acid lipoic Thiamin CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Vi sinh vật điển hình Lactobacillus plantarum Lactobacillus arabinosus Lactobacillus casei Streptococcus faecalis Leuconostos citrovorum Streptococcus faecalis Lactobacillus casei Lactobacillus arabinosus Leuconostoc menssenteroides Streptococcus faecalis Lactobacillus casei Streptococcus lactic Lactobacillus casei Leuconostoc menssenteroides Streptococcus faecalis Lactobacillus acidophyllus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Streptococcus lactic Streptococcus faecalis Lactobacillus fermenti Streptococcus lactic Lactobacillus plantarum Trang 15 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Biotin Bioxitin Leuconostoc menssenteroides Streptococcus faecalis Lactobacillus arabinosus Lactobacillus casei 2.1.4. Nhu cầu về các muối khoáng: Để đảm bảo cho sự sinh trƣởng phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều hợp chất vô cơ nhƣ P, S, Mg, Ca, Zn, Mn, Fe, Na, Cl. Đối với lactobacillus thì Mn2+, Mg2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic. - Các nguyên tố đa lƣợng: là những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phỉa cung cấp với liều lƣợng lớn - Các nguyên tố vi lƣợng: là những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải đƣợc cung cấp với liều lƣợng rất nhỏ. - Các nguyên tố khoáng: + P : chiếm tỉ lệ cao nhất trong các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật, có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào ( acid nucleic, phophoprotein, photpholipid…) + S : là khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật trong một số acid amin (xixtrin,xixtein, metioin), một số vitamin (biotin, tiamin…) + Mg : nguyên tố vi sinh vật đòi hỏi với lƣợng khá cao, tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình photphoryl hóa. + Ca : có vai trò quan trọng đáng kể trong việc xây doing cấu trúc tinh vi của tế bào,vai trò cầu nối trung gian giữa các thành phần quan trọng của tế bào sống. + Zn : tham gia vào nhiều quá trình enzyme, có tác dụng đáng kể trong việc hoạt hóa các enzyme. + Mn : chứa trong một số enzyme hô hấp, có vai trò trong việc hoạt hóa một số enzyme. CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 16 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Bảng 6: Thành phần môi trường nuôi cấy Casein peptone, tryptic digest Cao thịt (Meat extract) Cao nấm men (Yeast extract) Glucose Tween 80 K2 HPO4 CH3 CO2 Na (Acetat Natrium) (NH4 )2 citrate (Citrat ammonium) MgSO 4 x 7 H2 O MnSO 4 x H2 O Điều chỉnh sao cho pH khoảng 6.2 - 6.5. 10.00 10.00 5.00 20.00 1.00 2.00 5.00 g/l g/l g/l g/l g/l g/l g/l 2.00 g/l 0.20 0.05 g/l g/l  Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic Sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chịu tác động của các yếu tố môi trƣờng nhƣ: Nhiệt độ: -Hoạt động trao đổi chất là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào -Các tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn lactic bị chết ở nhiệt độ cao, protein bị biến tính -Nhiệt độ thấp có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất do thay đổi hình không gian của một số permeaza chứa trong màng hoặc ảnh hƣởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dƣỡng. - Mỗi loài vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối thích khác nhau. Vi khuẩn lactic có thể phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 - 50 C và đƣợc phân thành hai nhóm: Nhóm ƣa ấm (mesophilic): phát triển ở nhiệt độ trung bình,nhiệt độ phát triển tối ƣu là :25-35 C Nhóm ƣa nhiệt (thermophilic): thƣờng phát triển ở nhiệt độ tƣơng đối cao 37-45 C pH: có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của các vi khuẩn lactic. pH tối ƣu cho sự sinh phát triển của chúng nằm trong khoảng 5.5-6.5. Quá trình lên men bị ức chế mạnh tại pH dƣới 4.5. Oxy: vi khuẩn lactic thuộc loại vi hiếu khí , hàm lƣợng oxy nhiều sẽ là một chất độc đối với vi khuẩn lactic. CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 17 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Độ ẩm: nƣớc là môi trƣờng cho các phản ứng trong tế bào do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Áp suất thẩm thấu: màng tế bào chất của vi khuẩn là màng bán thấm. Khi nồng độ muối trong môi trƣờng nuôi cấy cao (trên 2%) sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic. 3. Thanh trùng môi trƣờng Môi trƣờng sau khi đƣợc pha chế sẽ qua thanh trùng nhiệt để tiêu diệt, ức chế vi sinh vật và hoạt tính enzyme trong môi trƣờng, tạo điều kiện cho giống phát triển. Theo lý thuyết, nếu nhiệt độ thanh trùng càng cao với thời gian càng dài thì mức độ tiêu diệt và vô hoạt enzyme càng cao, tuy nhiên giá trị dinh dƣỡng của môi trƣờng sẽ bị giảm: o Vitamin bị phân huỷ. o Một phần đƣờng khử và acid amin tham gia phản ứng Maillard làm giảm hàm lƣợng cơ chất cacbon và nguồn nitơ của môi trƣờng Trong thực tế, tuỳ thuộc vào giống VSV, thành phần hoá học của môi trƣờng và mức độ nhiễm VSV trong các nguyên liệu pha chế môi trƣờng mà các nhà sản xuất sẽ đề xuất chế độ thanh trùng với giá trị nhiệt độ và thời gian thích hợp, thƣờng áp dụng chế độ thanh trùng dao động trong khoảng 80 - 90 C trong 30 - 60 phút.   Phƣơng pháp thực hiện: thiết bị ống lồng ống Thông số công nghệ nhiệt độ 85-900 C a. Cấu hình nhiều kênh ; b. Cấu hình nhiều ống Hình 8 : Thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 18 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic 4) Nhân giống Yêu cầu Số lƣợng tế bào trong môi trƣờng nuôi lên giá trị cao nhất, trong khoảng thời gian ngắn nhất, với những chi phí thấp nhất về nguyên liệu và năng lƣợng. a. Sinh khối thu đƣợc phải có hoạt tính lên men cao, tỷ lệ tế bào chết càng thấp càng tốt. Trong quá trình nhân giống cần đảm bảo cho giống đƣợc thuần khiết, điều này rất quan trọng vì nếu giống có lẫn các vi sinh vật lạ thì trong quá trình lên men sẽ gây hƣ hỏng và làm sản phẩm không đạt yêu cầu và đôi khi còn có hại cho ngƣời tiêu thụ. b. Cơ sở khoa học của quá trình nhân giống Chọn môi trƣờng với thành phần cơ chất thích hợp để nuôi vi sinh vật. Chọn phƣơng pháp và các điều kiện nuôi tối ƣu (pH, nhiệt độ, sự cung cấp oxi,...) cho quá trình tăng sinh khối của giống. Mục đích: tăng số lƣợng VSV c. Tiến hành nhân giống Để cấy giống, một lƣợng canh trƣờng vi khuẩn xác định đƣợc cho vào môi trƣờng dinh dƣỡng đã đƣợc xử lý nhiệt sau khi điều chỉnh đến nhiệt độ thích hợp. Để ngăn chặn những bất thƣờng trong canh trƣờng, điều quan trọng nhất là lƣợng giống cấy, nhiệt độ nuôi cấy và thời gian nuôi cấy phải đƣợc giữ không đổi trong suốt tất cả các giai đoạn.  Trong PTN: Giống đƣợc nhân trong các bình cầu. khi nhiệt độ khỏang 37 – 40 o C, cho canh trƣờng lỏng vào, tỷ lệ 5% thể tích. Giữ ở 40 – 45o C, sau 8 -10h, giống đạt yêu cầu. có thể dùng nhân giống tiếp tục ở các thể tích lớn hơn. CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 19 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic SƠ ĐỒ TỔNG QUÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI SINH VẬT CHO SẢN XUẤT CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 20