Tài liệu Chuyển gen và các phương pháp chuyển gen ở thực vật

CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT KHÁI NIỆM CHUNG MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT XU HƯỚNG ÁP DỤNG VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT CÁC ĐẶC ĐIỂM ƯU VIỆT CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN SO VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG TRUYỀN THỐNG Kỹ thuật di truyền Là kỹ thuật chuyển gen để tạo ra giống cây trồng, vật nuôi hay vi sinh vật như ý muốn của con người Gene Một phân đoạn ADN trên nhiễm sắc thể chịu trách nhiệm về một đặc tính của sinh vật Khái niệm chung Gen là gì? Gen là một đơn vị của vật chất di truyền. Bản thân nó hoặc kết hợp với các gen khác quy định một tính trạng của cơ thể. Về mặt phân tử, một gen là một đoạn ADN (ở một số virút là ARN) mã hoá hoặc trực tiếp hoặc tham gia vào việc tổng hợp nên một phân tử protein, hay trong một số trường hợp là các phân tử ARN ribosom (rARN), hoặc ARN vận chuyển (tARN), hoặc một số các phân tử ARN cấu trúc khác. Gen (ADN) -> ARN -> Protein -> Tính trạng Khái niệm chung Biến nạp gen ở thực vật là gì? Biến nạp gen (chuyển gen / kỹ thuật di truyền) ở thực vật là khái niệm dùng mô tả quá trình chuyển một hoặc một số gen ngoại lai vào trong tế bào thực vật nhằm tạo ra một tính trạng mới mà trước đó cơ thể thực vật đó không có. Quá trình biến nạp gen được coi là thành công khi gen biến nạp sau quá trình chuyển gen kết hợp ổn định với ADN của hệ gen nhân của tế bào biến nạp. Tế bào biến nạp này sau đó được tái sinh thành cây hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen biến nạp, và duy trì ổn định trong các thế hệ sau nhờ quá trình thụ tinh bình thường. Nguồn gốc của gen biến nạp Các gen biến nạp có thể có nguồn gốc khác nhau. Nó có thể được tách ra từ một nguồn tế bào khác có trong tự nhiên, hoặc được tổng hợp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. MỤC ĐÍCH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT 1. Nghiên cứu và làm sáng tỏ chức năng của một gen được quan tâm hay từng phần của gen đó. 2. Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào. 3. Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu nhận được các tính trạng mới ở tế bào và cây chuyển gen. Trong đó, các gen quy định các tính trạng mong muốn được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả, gồm: + Các gen kháng bệnh (virus, nấm, vi khuẩn, sâu bệnh, giun tròn…) + Gen chịu hạn, lạnh, và các diều kiện bất lợi khác của môi trường + Gen kháng thuốc diệt cỏ + Gen cải tạo các đặc tính về chất lượng (thay đổi thành phần axít béo, tăng cường thành phần axít không no, tăng cường thành phần các axít amin không thay thế, gen chín chậm, v.v…) QUÁ TRÌNH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT ĐƯỢC THỰC HIỆN NHƯ THẾ NÀO? Giai đoạn 1. Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp). Trong giai đoạn này, gen mong muốn thường được chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật. Giai đoạn 2. Giai đoạn tái sinh cây. Trong giai đoạn này, các mô tế bào được chuyển gen được chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây. Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp. Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công. CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN ĐỐI VỚI HỆ THỐNG TÁI SINH - Các phương pháp chuyển gen (biến nạp gen) đều chuyển gen vào các tế bào, hay mô – nói cách khác tế bào và mô là đơn vị tiếp nhận gen mới. - Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng phân chia in vitro nhanh. - Các mô, tế bào này phải có khả năng tiếp nhận gen mới. - Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen. - Cây tái sinh phải có tỷ lệ sống (khi đưa ra ngoài đất trồng) cao, tần số biến dị thấp (tối thiểu), và khả năng hữu thụ cao để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để tiếp tục tiến hành chuyển gen trong điều kiện in-vivo sau này. hệ thống tái sinh là điều kiện tiên quyết để thực hiện thành công biến nạp gen Các loại mô sử dụng làm hệ thống tái sinh: ► Phải có khả năng tái sinh cao và thuận lợi cho việc chuyển gen. ● Phôi non, phôi trưởng thành ●Mô sẹo có nguồn gốc khác nhau. ●Mô lá, thân mầm VÍ DỤ VỀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÁC CÂY BIẾN NẠP TỪ CÁC TẾ BÀO KHÁC NHAU Dạng tế bào / mô đích PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÂY BIẾN NẠP Tế bào hoặc mô nuôi cấy in vitro (cultured cells / tissues) Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), hoặc phát sinh phôi (embryogenesis). Phôi non (immature embryos), hoặc các tế bào đang phát sinh cơ quan (organogenic cells) Tái sinh cây in vitro từ các dòng tế bào biến nạp Các tế bào ở phôi non, và mô phân sinh hoa Sự phát triển tiếp tục của phôi, chồi, hay hoa sẽ cho một cây khảm. Hạt phấn có nguồn gốc từ các dòng tế bào biến nạp được sử dụng cho việc tạo ra các hạt cây được biến nạp thông qua quá trình thụ tinh bình thường Tạo các cây biến nạp trực tiếp qua con đường thụ tinh với hạt phấn chín (mature pollens) đang phát triển mà ADN của nó đã được xử lý biến nạp Hạt phấn Tạo các cây biến nạp trực tiếp qua con đường thụ tinh với hạt phấn chín (mature pollens) đang phát triển mà ADN của nó đã được xử lý biến nạp GIAI ĐOẠN CHUYỂN GEN Các véctơ chuyển gen Các véctơ chuyển gen là các phân tử ADN mang đoạn gen cần biến nạp. Ngoài ra chúng còn có các đoạn ADN có cấu trúc đặc thù nhằm tăng hiệu quả các các quá trình biến nạp giúp quá trình biến nạp có thể thực hiện được. Eukaryote Promoter Cấu trúc của véctơ chuyển gen Vùng gắn enzyme giới hạn (MCS) Vùng 3’ chứa tín hiệu polyadenine hoá Gen được biến nạp Eukaryote Promoter ATG Gen kháng kháng sinh Vi khuẩn Prokaryote Promoter Điểm tái bản Vi khuẩn 3’- PolyA TAG Gen chỉ thị chọn lọc SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 1. Có một đoạn ADN khởi động (promoter). Đây là một đoạn ADN có liên quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã. Nó thường có một vị trí bám cho enzym ARN polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí bám khác của các protein điều khiển / điều hoà quá trình phiên mã (CaMV35S-promoter, nos-promoter …) Eukaryote Promoter Cấu trúc của véctơ chuyển gen Vùng gắn enzyme giới hạn (MCS) Vùng 3’ chứa tín hiệu polyadenine hoá Gen được biến nạp Eukaryote Promoter ATG Gen kháng kháng sinh Vi khuẩn Prokaryote Promoter Điểm tái bản Vi khuẩn 3’- PolyA TAG Gen chỉ thị chọn lọc SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 2. Có một đoạn ADN kết thúc (terminator). Đây là đoạn ADN cần thiết cho sự kết thúc của quá trình phiên mã và giải phóng phân tử mARN khỏi sợi khuôn ADN. Đoạn kết này thường có một trật tự tín hiệu polyadenin, như AATTAA hoặc AACCAA, giúp cho phân tử mARN bền vững hơn. Cấu trúc của véctơ chuyển gen Eukaryote Promoter Vùng gắn enzyme giới hạn (MCS) Vùng 3’ chứa tín hiệu polyadenine hoá Gen được biến nạp Eukaryote Promoter ATG 3. Một đoạn ADN chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản (replication; Điểm tái bản) thường có nguồn gốc vi khuẩn, như ColE1. Gen kháng kháng sinh Vi khuẩn Prokaryote Promoter Điểm tái bản Vi khuẩn 3’- PolyA TAG Gen chỉ thị chọn lọc SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 4. Một đoạn ADN chứa các trật tự nucleotid đặc trưng cho sự nhận biết của các enzyme giới hạn, thường ký hiệu là MCS (multi-cloning sites). Nhờ đoạn ADN người ta có thể dùng enzym giới hạn đặc hiệu để cắt và tái tổ hợp phân tử ADN của véctơ với đoạn ADN mang gen cần biến nạp. Cấu trúc của véctơ chuyển gen Eukaryote Promoter Vùng gắn enzyme giới hạn (MCS) Vùng 3’ chứa tín hiệu polyadenine hoá Gen được biến nạp Eukaryote Promoter ATG Gen kháng kháng sinh Vi khuẩn Prokaryote Promoter Điểm tái bản Vi khuẩn 3’- PolyA TAG Gen chỉ thị chọn lọc SƠ ĐỒ CHUNG CHO VÉCTƠ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 5. Các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes). Các gen này thường tổng hợp nên các phân tử protein giúp phân biệt các tế bào đã được biến nạp khỏi các tế bào không được biến nạp (gen chọn lọc), hoặc ghi nhận sự hoạt động của gen biến nạp (gen chỉ thị). GIỚI THIỆU VỀ GEN CHỌN LỌC (selectable marker gene) Các gen chọn lọc thường có tính trội, thông thường có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng hoạt động của chúng được kiểm soát bởi các promoter kiểu Eukaryote. Các gen chọn lọc phổ biến gồm: ۞ Các gen kháng kháng sinh như kanamycin (neomycin phosphotransferase-nptII), hygromycin (hygromycin phosphostransferasehpt), streptomycin (streptomycin phosphotransferaza),... ۞ Các gen kháng chất diệt cỏ, như glyphosate hoặc bialaphos (phosphinothricin, BASTA): gen bar có nguồn gốc vi khuẩn mã hoá cho enzyme làm bất hoạt BASTA là phosphinothricin acetyltransferaza (PAT). ۞ Các gen khác (gen pmi – phosphate manose isomerase- chuyển hoá manose thành glucose. Nhờ vậy, cây có thể sống trên môi trường không có glucose (manose là nhân tố chọn lọc) BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Các nhân tố chọn lọc - Kanamycin - Hygromycin - Basta - Manose GEN CHỈ THỊ (reporter gene) ♣ Các gen gen chỉ thị là các gen có trách nhiệm thông báo là gen cần biến nạp đã gắn vào hệ gen thực vật và bắt đầu hoạt động hay chưa. ♣ Các gen chỉ thị thường được dùng bao gồm: + β - galactosidase * + β - glucuronidase (GUS) * + Neomycin-phosphatase (NPT) + Chloramphenicol-acetyl transferase (CAT) + Alkaline phosphatase + Luciferase * + Protein phát huỳnh quang xanh lục GFP * (green fluorescence protein) và các dẫn xuất của nó. + Protein chuyển trạng thái năng lượng cộng hưởng phát huỳnh quang FRET (fluorescent resonance energy transfer) β- galactosidase & β - glucuronidase Lactose β-D-glucuronide +H2O X-Gal β - galactosidase β - glucuronidase Không màu 5-Brom-4-chlor-3-idolyl-β-Dgalactoside Axit glucuronic +Glucose X-Gluc 5-Brom-4-chlor-3-idolyl-β-Dglucuronid β - glucuronidase β - galactosidase 5-Brom-4-chlor-indigo Galactose +Glucose Màu xanh sẫm 5-Brom-4-chlor-indigo