Tài liệu Chuyên đề enzim + đề thi hsg quốc gia

CHUYÊN ĐỀ: ENZIM VÀ VAI TRÒ CỦA ENZIM TRONG QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA VẬT CHẤT PHẦN I: MỞ ĐẦU I.1. Lí do chọn đề tài “Nâng cao dân trí - Đào tạo nhân lực – Bồi dưỡng nhân tài” luôn là nhiệm vụ trung tâm của giáo dục - đào tạo cũng như của toàn xã hội để mỗi quốc gia có thể theo kịp với sự phát triển như vũ bão của khoa học công nghệ trong xu thế toàn cầu hóa như hiện nay. Trong đó việc phát hiện và bồi dưỡng những học sinh có năng khiếu về các môn học ở bậc học phổ thông chính là bước khởi đầu quan trọng để góp phần đào tạo các em thành những người đi đầu trong các lĩnh vực của khoa học và đời sống. Chính vì vậy, công tác bồi dưỡng học sinh giỏi là nhiệm vụ tất yếu của ngành giáo dục và đào tạo, của mỗi nhà trường và cũng là nhiệm vụ quan trọng của mỗi giáo viên. Việc đánh giá chất lượng giảng dạy trong các trường chuyên, đặc biệt là các học sinh giỏi được thể hiện trong các kỳ thi học sinh giỏi các cấp. Tuy nhiên, thực tế cho thấy nội dung giữa kiến thức sách giáo khoa chuyên với nội dung kiến thức thi học sinh giỏi Quốc gia còn là một khoảng cách rất lớn đòi hỏi giáo viên giảng dạy phải có một vốn kiến thức cơ bản vững chắc, không ngừng nâng cao chuyên môn, tìm tòi các tài liệu và cập nhật các đề thi thì mới đáp ứng được yêu cầu bồi dưỡng học sinh giỏi. Kiến thức về enzim là một phần kiến thức nền tảng rất quan trọng để các em hoc tốt các mảng kiến thức khác về sau như: chuyển hóa vật chất và năng lượng trong tế bào và vi sinh vật, quang hợp, hô hấp, tiêu hóa, tương tác gen…Trong khi đó chương trình sinh học phổ thông, nội dung về enzim được đề cập đến còn sơ sài chỉ trong thời lượng một tiết. Các nguồn học liệu khác về enzim có nguồn thì quá sơ sài, có nguồn lại quá chuyên sâu đối với trình độ của học sinh trung học phổ thông. Tôi mong có tài liệu cho giáo viên tham khảo khi giảng dạy chương trình chuyên sinh và cho học sinh khi tham gia các kì thi HSG với nội dung đầy đủ nhưng dễ hiểu và phù hợp với học sinh trung học phổ thông. Vì những lý do trên nên tôi quyết định chọn đề tài: “Cấu tạo và cơ chế hoạt động của enzim” I.2 – Mục đích của chuyên đề I.2.1. Nội dung khoa học - Chuyên đề nhằm hệ thống hóa được các kiến thức về enzim, đặc biệt phân tích kĩ về cấu trúc và cơ chế xúc tác của enzim một cách dễ hiểu và bám sát chương trình sách giáo khoa chuyên. Bên cạnh đó là giới thiệu một số thí nghiệm có thể thực hiện được trong trường phổ thông. Chuyên đề có thể dùng cho học sinh khá, giỏi ở lớp chọn, lớp chuyên sinh học ở bậc THPT. - Bước đầu đi xây dựng một số câu hỏi và bài tập vận dụng cho việc giảng dạy, luyện tập học sinh trong các trường chuyên và các đội tuyển học sinh giỏi. Từ đó góp phần hoàn thiện hệ thống các câu hỏi phục vụ cho công tác bồi dưỡng HSG . I.2.2. Thực tiễn Nội dung chuyên đề sẽ là tài liệu bổ ích cho chúng tôi trong quá trình giảng dạy và bồi dưỡng học sinh khá, giỏi sinh học sau này. Đồng thời chúng tôi hy vọng nó có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho giáo viên khác trong giảng dạy ở lớp chọn, lớp chuyên, bồi dưỡng HSG Sinh học bậc THPT và còn làm tài liệu học tập cho học sinh. PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG I. LÝ THUYẾT VỀ ENZIM I. SƠ LƯỢC VỀ ENZIM Thuật ngữ enzim được nhà sinh lí học người Đức Vilgelrn Kuner đặt tên vào năm 1878 là xuất xứ từ tiếng Hi Lạp là enzime (en – là ở trong, zime – là nấm men) bởi vì enzim là chất xúc tác sinh học đầu tiên được nghiên cứu ở nấm men do tế bào nấm men tiết ra có tác dụng tạo nên sự lên men (lên men rượu) và lúc đầu được gọi là chất men (fermen – từ thuật ngữ fermentation là sự lên men). Enzim là chất xúc tác sinh học được tổng hợp trong các tế bào sống. Enzim chỉ làm tăng tốc độ phản ứng mà không bị biến đổi sau phản ứng. * Các dạng tồn tại của enzim trong tế bào: - Hoà tan trong tế bào chất như enzim của quá trình đường phân. - Liên kết chặt chẽ với những bào quan xác định như lizoxom, ti thể, lục lạp. Mỗi loại bào quan trong tế bào đều có cấu trúc và chức năng riêng với những hệ enzim đặc hiệu, với cấu trúc như vậy enzim được phân bố thành từng ngăn riêng biệt. Sự khu trú và sắp đặt các enzim một cách hợp lý trong cấu trúc của tế bào, làm cho các phản ứng enzim có tính chất định hướng, có phối hợp với nhau tạo ra những hệ thống phản ứng dây truyền liên tục, nhịp nhàng ăn khớp với nhau. Cần chú ý rằng, các cấu trúc màng trong tế bào có tính thấm chọn lọc. Chính tính thấm chọn lọc này làm tăng thêm tính đặc hiệu của các ngăn trong tế bào. Một điều đáng chú ý nữa là trong tế bào sống nguyên vẹn, enzim thường chưa hoạt động tới mức tối đa và những điều kiện trong cơ thể cũng chưa phải là điều kiện thích hợp nhất cho sự hoạt động của enzim. Đây chính là những điều kiện quan trọng giúp cho cơ thể điều hòa các quá trình chuyển hóa. Enzim được tổng hợp trong tế bào trên các riboxom và được sử dụng trong tế bào (gọi là enzim nội bào) hoặc được tiết ra khỏi tế bào vào môi trường ngoại bào (enzim ngoại bào). VD enzim amilaza, pepsin… động vật tiết vào ống tiêu hóa để tiêu hóa thức ăn. II. CẤU TRÚC CỦA ENZIM 1. Thành phần Hầu hết các enzim có bản chất là prôtêin hoặc prôtêin kết hợp với chất khác, trừ một nhóm nhỏ các phân tử ARN có khả năng xúc tác gọi là ribozim - Enzim là một protein, gọi là enzim một thành phần. - Enzim hai thành phần (holoenzim), gồm protêin (apôenzim) kết hợp với nhóm khác không phải là protein (côfactor). Côfactor có thể gắn chặt vào phần apoenzim, hoặc chỉ liên kết lỏng lẻo và có thể tách ra khi cho thẩm tích qua màng. Các côfactor có thể là các chất vô cơ thường là các ion kim loại như sắt, đồng, kẽm, niken, magiê, mangan…Côfactor có thể là chất hữu cơ, thường là các vitamin, trường hợp này cofactor gọi là côenzim. Rất nhiều vitamin, các chất dinh dưỡng cần với một lượng nhỏ trong bữa ăn là các tiền chất enzim. Đa số enzim thuộc loại hai thành phần. + Apoenzim quyết định tính đặc hiệu cao của enzim và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzim. + Coenzim quyết định kiểu phản ứng mà enzim xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzim đối với các yếu tố gây biến tính. Một coenzim khi kết hợp với các apoenzim khác nhau tạo thành các holoenzim khác nhau, xúc tác cho quá trình chuyển hoá các chất khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng. - Vai trò của các kim loại trong phân tử enzim: + liên kết giữa enzim với cơ chất, VD: Mn trong aminopeptidaza + liên kết giữa apoenzim và coenzim, VD: Zn liên kết coenzim NAD + với alcohol dehydrogenaza. + tham gia trực tiếp vào sự vận chuyển điệ tử. VD: Fe trong xytocrom, peroxidaza. + đảm bảo cho sự ổn định của phân tử enzim, giữ vững sự kết hợp giữa các đơn vị cấu tạo để tạo nên phân tử enzim. 2. Cấu trúc Mỗi loại enzim có cấu trúc không gian đặc thù, đặc biệt là vùng trung tâm hoạt động (TTHĐ). Trung tâm hoạt động được cấu tạo bởi một số axit amin đặc thù và làm cho trung tâm có thù hình không gian đặc trưng. Mặc dù trung tâm hoạt động của mỗi loại enzim mang tính đặc thù, nhưng một số đặc điểm chung có thể được rút ra như sau: + TTHĐ chỉ chiếm 1 tỉ lệ thể tích tương đối nhỏ của phân tử enzim. + TTHĐ có cấu trúc ba chiều, các axit amin và cofactor trong TTHĐ được gắn kết theo một sự sắp xếp chính xác với vị trí khác của phân tử cơ chất + TTHĐ là chỗ lõm xuống hay một khe nhỏ ở trên bề mặt của enzim để liên kết với cơ chất. Cấu trúc như vậy có tác dụng đẩy phần lớn dung môi ra ngoài, nếu không, khả năng xúc tác của enzim sẽ giảm. + TTHĐ gồm nhiều nhóm chức khác nhau của a.a, phân tử nước liên kết và trong nhiều trường hợp có cả ion kim loại, các nhóm chức của coenzim. +Trung tâm hoạt động là nơi liên kết tạm thời với cơ chất. Theo quan điểm trước đây của Emil Fishcher, trung tâm hoạt động vốn có cấu hình không gian tương thích với cấu hình không gian của cơ chất, cũng như sự tương ứng giữa ổ khóa với chìa khóa. Theo quan điểm hiện nay, khi enzim tương tác với cơ chất, các nhóm chức ở TTHĐ có thể thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể cơ chất, vì vậy gọi là “khớp cảm ứng”. Một số enzim còn có trung tâm phụ được gọi là trung tâm điều chỉnh → có tác dụng điều chỉnh hình thù của trung tâm hoạt động. 3. Cấu trúc nhiều chuỗi và cấu trúc dị lập thể của enzim - Cấu trúc nhiều chuối: Có loại enzim chỉ có một chuỗi polypeptit, cũng có loại do nhiều chuối polipeptit tạo nên, nghĩa là enzim có các bậc cấu trúc của protein (bậc 1, 2, 3, 4). Mỗi chuỗi polipeptit được gọi là một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị trong một phân tử enzim có thể giống, có thể khác nhau. Thông thường cá enzim có từ 2-4 tiểu đơn vị, có trường hợp enzim có tới 12 -20 chuỗi polipeptit. Hoạt tính xúc tác của enzim phụ thuộc vào sự nguyên vẹn cấu hình riêng của protein. Nếu enzim bị mất cấu trúc thì hoạt tính xúc tác của nó bị mất hoàn toàn. Do đó cấu trúc bậc 1,2,3 và 4 của các protein enzim rất cần thiết cho hoạt động xúc tác của chúng. - Enzim dị lập thể: còn gọi là enzim điều hòa hay enzim allosteric, là những enzim điều hòa đặc hiệu trên những vị trí đặc biệt của mạng lưới chuyển hóa, đặc biệt là những quá trình sinh tổng hợp. Ở enzim điều hòa, ngoài trung tâm hoạt động còn có 1 vị trí khác có thể tương tác với các chất khác gọi là trung tâm dị lập thể hay trung tâm điều hòa (trung tâm allosteric). Các chất kết hợp vào trung tâm này được gọi là các chất điều hòa dị lập thể. Khi các chất này kết hợp với enzim làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzim, của trung tâm hoạt động, do đó làm thay đổi hoạt động xúc tác của enzim. Chất làm tăng hoạt động của enzim được gọi là chất điều hòa dương. Chất làm giảm hoạt độ của enzim gọi là chất điều hòa âm. Điều đáng lưu ý là các chất điều hòa không làm thay đổi tác dụng của enzim, trong nhiều trường hợp, có thể “khóa” trung tâm điều hòa nhưng trung tâm hoạt tính vẫn hoạt động. Enzim lập thể là những enzim có cấu trúc bậc 4, do nhiều tiểu đơn vi cấu tạo nên. Các tiểu đơn vị liên kết với nhau bằng các liên kết yếu, do đó chúng có thể tách rời ra và kết hợp lại một cách thuận nghịch. Do đặc điểm cấu tạo này, enzim dị lập thể có thể tồn tại ở nhiều trạng thái không gian khác biệt nhau (ít nhất là 2 trạng thái) và có thể biến đổi thuận nghịch từ trạng thái này sang trạng thái khác một cách dễ dạng. Vì có cấu trúc bậc 4 nên trong phân tử enzim dị lập thể thường có 2 hay một số trung tâm hoạt động, có thể kết hợp với 2 hay một số phân tử cơ chất. Nếu cơ chất thực hiện chức năng điều hòa gọi là điều hòa đồng thể. Nếu chất điều hòa có cấu trúc khác cơ chất gọi là điều hòa dị thể. Thông thường các enzim lập thể được điều hòa theo kiểu hỗn hợp vừa là đồng thể, vừa dị thể. VD một số enzim dị lập thể: + Aspartat transcacbamoylaza (ATCaza): xúc tác phản ứng ngưng tụ cacbamoyl photphat với aspartate thành cacbamoyl aspartate, là sản phẩm đầu tiên trên con đường sinh tổng hợp pyrimidin và nucleotit của nó (CTP) Enzim này có cấu trúc bậc 4 gồm 12 tiểu đơn vị, KH C 6H6 nghĩa là có 6 tiểu đơn vị C có chức năn xúc tác và 6 tiểu đơn vị R có chức năng điều hòa, một đơn vị xúc tác có 3 trung tâm hoạt động và toàn phân tử enzim sẽ có 6 trung tâm hoạt động. Người ta có thể dùng thủy ngân để “khóa” trung tâm điều khiển của ATCaza, làm cho enzim mất tính điều hòa dị lập thể, nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác bình thường theo phương trình Michaelis + Axetyl – CoA cacboxylaza: làm nhiệm vụ điều hòa phản ứng đầu tiên trong quá trình tổng hợp mới axit béo. Tồn tại ở dạng đơn thể (không hoạt tính) và đa thể (có hoạt tính). Enzim đòi hỏi phải có xitrat hoặc isoxitrat làm chất điều hòa dương: + xitrat ⇔ Nhiều monome −xitrat polymer 4. Vai trò của các nhóm chức năng trong phân tử enzim Bản chất của enzim là protein, phân tử của chúng gồm hàng tram hoặc hàng ngàn gốc axit amin. Hầu hết các axit amin đều có mạch nhánh. Các mạch nhánh này thường ở trang thái tự do, có thể tham gia vào những phản ứng hóa học nhất định. Các nhóm này tạo nên các nhóm chức năng của TTHĐ; có những nhóm trực tiếp tham gia vào hoạt độn xúc tác; có những nhóm khác làm nhiệm vụ kết hợp và định hướng cho cơ chất và coezim tạo nên bộ phận tiếp xúc của enzim. Tuy nhiên, ta không thể xác định được một ranh giới rõ rệt giữa các nhóm “xúc tác” và các nhóm “tiếp xúc” vì những nhóm tiếp xúc cũng thường tham gia vào sự xúc tác. Các nhóm chức năng thường nằm ở những bộ phân khác nhau trong các chuỗi polypeptit của phân tử enzim, nhưng do sự cuộn khúc của các mạch peptit làm cho các nhóm đó kề lại gần nhau về không gian và đinh hướng theo một cách nhất định. Sự phá hủy hoặc khóa một nhóm chức nào đó thường gây ra sự kìm hãm, hoặc làm chậm phản ứng xúc tác. Khi cấu trúc bậc ba hay bậc bốn của phân tử enzim bị thay đổi vì lý do vật lý hay hóa học nào đó, cũng thường gây tổn hại đến cấu trúc đặc biệt của TTHĐ, làm rối loạn sự định hướng tương hỗ của các nhóm chức năng. Các nhóm chức thường có trong phân tử enzim bao gồm: (1) Các nhóm cacboxyl của axit aspartic và axit glutamic (2) Nhóm α- amin của lysine (3) Nhóm guanidine của arginine (4) Nhóm indol của tryptophan (5) Nhóm imidazole của histidin (6) Nhóm hydroxyl của serin và treonin (7) Nhóm phenol của tyosin (8) Nhóm sulfuhydyl của xystein (9) Nhóm thioete của metionin (10) Những mạch béo của những axit amin khác và vòng thơm của phenyalanin Các nhóm chức tham gia vào hoạt động xúc tác của enzim bằng nhiều cơ chế. Nhờ khả năng nhường hoặc nhận proton, chúng có thể hoạt động như những chất xúc tác. Chúng cũng có thể liên kết bằng liên kết cộng hóa trị vơi cơ chất tạo thành phức hợp enzim - cơ chất có hoạt tính cao, để thực hiện cơ chế xúc tác cộng hóa trị. Trong các enzim có chứa kim loại, nhiều trường hơp chính ion kim loại đóng vai trò trung gian giữa nhóm chức năng của enzim và cơ chất. Ion kim loại là những chất mang điện tích dương, có thể đóng vai trò chất hút điện tử rất mạnh và do đó tham gia vào cơ chế phản ứng rất có hiệu lực. Trong một số enzim loại thủy phân, nhất là loại thủy phân liên kết peptit, thường có chứa những ion kim loại như Mg 2+, Mn2+, Zn2+… Những ion này có thể đóng vai trò chất hút điện tử trong cơ chế phản ứng enzim và có thể gây tác dụng phân cực. Những enzim cần coenzim thì chính nhóm chức năng của coenzim được coi như nhóm hoạt động của enzim. 5. Các tiền chất enzim Phần lớn các enzim được tổng hợp trong cơ thể thành từng phân tử enzim có hoạt tính, nhưng có một số enzim khi mới tổng hợp không có hoạt tính xúc tác gọi là tiền chất enzim (proenzim hoặc zymogen). Quá trình chuyển hóa zymogen thành enzim gọi là quá trình hoạt hóa enzim. Quá trình này có thể là tự xúc tác hoặc do các protein enzim tương ứng xúc tác (VD: propepsinogen pepsin > pepsin).  Hiện tượng tổng hợp ra các zymogen có ý nghĩa sinh học quan trọng, VD các enzim trong ống tiêu hóa được tổng hợp qua giai đoạn trung gian như vậy chính là một cơ chế tự bảo vệ của cơ thể, vi nếu không thì chính các tuyến đã tổng hợp nên các loại enzim này sẽ bị tiêu hủy bởi chính những enzim do chúng tổng hợp nên (VD các enzim của tuyến tụy hay tuyến dạ dày) III. ĐẶC TÍNH CỦA ENZIM - Hoạt tính mạnh: Được biểu hiện bằng số vòng quay, tức là số phân tử cơ chất được chuyển hóa trong thời gian một giây bởi 1 phân tử enzim (đa số enzim có số vòng quay từ 1000 - 10 000). Hoạt tính của enzim rất mạnh, với một lượng enzim nhỏ xúc tác cho một lượng cơ chất lớn, làm phản ứng xảy ra rất nhanh (gấp 10 8 – 1011 lần so với phản ứng không có xúc tác của enzim) VD: H2O2 H2O2 1 phân tử Fe  H2O + O2 300 năm 1 phân tử catalaza  H2O + O2 1 giây 1 (g) pepsin phân giải  50 kg lòng trắng trứng. - Tính chuyên hoá cao: nghĩa là đặc thù với cơ chất mà chúng tác động (tính đặc hiệu). + Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzim chỉ xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng chuyển hoá của một chất nhất định. VD: phản ứng OXH – K, chuyển vị, thuỷ phân… + Đặc hiệu cơ chất: Đặc hiệu tuyệt đối: đa số enzim chỉ có tác dụng trên một cơ chất nhất định: ureaz, acginaz, glucozooxiđaz. Đặc hiệu tương đối: Một số enzim có tính chuyên hoá tương đối, có khả năng hoạt động trên một số cơ chất khác nhau gần giống nhau về cấu trúc nhưng với tốc độ phản ứng sẽ khác nhau. + Đặc hiệu lập thể: Phần lớn enzim đều có tính đặc hiệu lập thể nghĩa là enzim chỉ tác dụng với một trong 2 dạng đồng phân không gian của các chất. + Đặc hiệu nhóm: Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: Enzim chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở gần liên kết chịu tác động. Vd mantaz. Đặc hiệu nhóm tương đối: mức độ đặc hiệu kém hơn nhóm trên ở chỗ enzim không có những đòi hỏi gì nghiêm ngặt đối với nhóm ở gần liên kết bị phân giải. VD lipaz xúc tác cho phản ứng thuỷ phân lipit. - Sự phối hợp hoạt động giữa các enzim: Trong tế bào các enzim hoạt động theo kiểu dây chuyền, nghĩa là sản phẩm của phản ứng trước sẽ là cơ chất cho enzim sau tác động. Các enzim trong hệ thống có thể tồn tại riêng ở dạng hòa tan, hoặc liên kết với màng, bào quan của tế bào (màng ti thể, riboxom…) hoặc kết tụ với nhau tạo phực hệ khá bền, khi tách riêng khỏi phức hệ enzim sẽ mất hoạt tính xúc tác. VI. CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA ENZIM 1. Cơ chế tác động của enzim Vai trò thiết yếu của một enzim trong hầu hết các quá trình sinh lý xuất phát từ 2 đặc tính cơ bản của nó: (1) các enzym làm tăng tốc độ các phản ứng hóa học; (2) các enzim hoạt động trên những trên những cơ chất đặc hiệu để tạo ra các sản phẩm phản ứng đặc hiệu. Hai tính chất này tạo cho enzim có khả năng tiến hành các biến đổi hóa học trong quá trình trao đổi chất với hiệu suất và độ chính xác cần thiết. Lúc đầu enzim liên kết với cơ chất tại trung tâm hoạt động mang tính đặc thù (enzim nào cơ chất ấy – phù hợp thù hình như chìa khóa và ổ khóa) → tạo hợp chất trung gian (enzim - cơ chất) → enzim tương tác với cơ chất → cuối phản ứng hợp chất sẽ phân giải cho sản phẩm và giải phóng enzim nguyên vẹn có thể xúc tác phản ứng với cơ chất mới cùng loại E + S → ES → E + S1 + S2 Sản phẩm của phản ứng này trở thành cơ chất cho phản ứng tiếp theo và sản phẩm cuối cùng khi được tạo ra nhiều thì lại trở thành chất ức chế enzim xúc tác cho phản ứng đầu tiên. Đối với các enzim có coenzim thì chỉ khi coenzim liên kết với enzim thì cấu hình của enzim mới phù hợp với cơ chất. Bằng cách sử dụng coenzim và trung tâm điều chỉnh, sự hoạt động của enzim được điều hòa linh hoạt đáp ứng mọi tình huống của tế bào. Mỗi enzim thường xúc tác cho một loại phản ứng. Enzim xúc tác cả hai chiều của phản ứng theo tỉ lệ tương đối của các chất tham gia phản ứng với sản phẩm được tạo thành. VD: A + B C. Nếu trong dung dịch có nhiều A, B thì phản ứng theo chiều tạo sản phẩm C. Nếu nhiều C hơn A, B thì phản ứng tạo thành A+B. Vậy tại sao enzim có thể xúc tác cho cả hai chiều của phản ứng nhưng các phản ứng sinh hóa trong tế bào lại xảy ra theo một chiều xác định? Đó là vì sản phẩm của phản ứng này là cơ chất của phản ứng tiếp theo. 2. Các liên kết giữa enzim và cơ chất Sự kết hợp của cơ chất (S) vào trung tâm hoạt động của enzim (E) tạo thành phức chất enzim – cơ chất (ES) là giai đoạn đầu tiên của phản ứng do enzim xúc tác. Giữa cơ chất và TTHĐ tạo thành nhiều tương tác yếu → dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng. Các liên kết chủ yếu được tạo thành trong phưc chất ES là tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước. (1) Tương tác tĩnh điện (còn được gọi là liên kết ion, liên kết muối hoặc cặp ion): liên kết này được tạo thành giữa nhóm tích điện của cơ chất với nhóm tích điện trái dấu trong phân tử enzim. (2) Liên kết hydro được tạo thành theo kiểu A – H….B, trong đó H kết hợp với A bằng liên kết cộng hóa trị, đồng thời tạo thành liên kết yếu với B. Liên kết hydro  được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B vào khoảng 3 A . (3) Tương tác Van der Waals yếu hoặc ít đặc hiệu hơn 2 liên kết kia. Vai trò của tương tác này thể hiện rõ khi nhiều nguyên tử của cơ chất có thể đồng thời tiếp cận với nhiều nguyên tử của enzim. Điều này chỉ có thể xảy ra khi có sự ăn khớp về hình dạng giữa cơ chất và enzim. Vì vậy, một tương tác Van der Waals không có tính đặc hiệu, nhưng tính đặc hiệu tăng lên khi có điều kiện để đồng thời tạo thành lượng lớn tương tác Van der Waals. Ngoài 3 loại tương tác kể trên còn có tương tác kị nước giữa các nhóm không phân cực cũng có vai trò quan trọng. Phản ứng enzim thường xảy ra trong môi trường nước có tính chất phân cực, do đó làm yếu tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, nhưng lại làm tăng cường tương tác kị nước. Khi cơ chất kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzim, nước bị đẩy ra khỏi vùng này, kết quả là hồi phục lại độ bền của tương tác tĩnh điện và liên kết hydro. 3. Sự tương đồng của trung tâm hoạt động với cơ chất Sự chọn lọc của các cơ chất đặc hiệu phản ánh sự tương đồng giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzim. Cuối thế kỉ XIX, Emil Fisher đã tổng kết tất cả các kết quả này trong mô hình ổ khóa và chìa khóa. Trong mô hình này, trung tâm hoạt động của enzim và phân tử cơ chất được thể hiện dưới dạng cấu trúc tĩnh và bổ sung với nhau về mặt hóa lập thể. Sự gắn cơ chất vào trung tâm hoạt động tĩnh của enzim tương tự như một chiếc chìa khóa khớp với ổ khóa, hoặc là một miếng ghép hình khớp với phần còn lại. Sự tương đồng giữa trung tâm hoạt động và cơ chất không chỉ tạo ra sự vừa khớp về mặt hóa lập thể mà cả hai cấu trúc đều phải tương đồng về mặt tĩnh điện để đảm bảo các điện tích trung hòa, tránh hiệu ứng loại bỏ. Cũng tương tự như vậy, hai cấu trúc cũng phải bổ sung cho nhau trong việc sắp xếp các tương tác kị nước và các tương tác liên kết hydro để có thể đạt được tương tác gắn cao nhất. Quá trình xúc tác của enzim thường chọn lọc về hình dạng lập thể theo vòng hoặc đối xứng lẫn nhau. Do sự nhận biết cơ chất phải có ít nhất ba điểm nối kết giữa enzim và phân tử cơ chất. Các quan điểm về mô hình ổ khóa – chìa khóa và sự kết nối 3 điểm giúp chúng ta giải thích sự chọn lọc cơ chất quá trình xúc tác của enzim. Tuy nhiên ngày nay đã có bằng chứng rõ ràng rằng, trung tâm hoạt động của enzim đã tiến hóa để khớp với cấu trúc của cơ chất ở trạng thái chuyển tiếp hơn là trạng thái ban đầu. Một VD điển hình là các phân tử ức chế có cấu trúc được thiết kế bắt chước với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng thì bám chặt với enzim hơn là cơ chất hay sản phẩm. Một giả thuyết nảy sinh là những điều chỉnh về mặt hình thể được sử dụng để xoắn vặn cơ chất, enzim hay cả cơ chất và enzim để đưa hệ thống về trạng thái chuyển tiếp, bằng cách đó tạo thuận lợi cho việc cắt đứt liên kết gây ra xúc tác. Đối với các phản ứng thuận nghịch sự vặn xoắn của phức hợp ES là một thành tố quan trọng trong xúc tác. Chúng ta tưởng tượng rằng, trung tâm hoạt động của enzim và trạng thái nền của cơ chất đều cứng nhắc về mặt hình thể. Cơ chất gắn với trung tâm hoạt động do trạng thái ban đầu của nó khớp hoàn chỉnh với khe này. Nếu như thế thì phân tử sản phẩm cứng nhắc sẽ không thể khớp với cùng cấu trúc trung tâm hoạt động cứng nhắc được. Enzim có thể vượt qua chướng ngại này bằng cách vặn xoắn sản phẩm liên kết theo một cách khá giống nếu trung tâm hoạt động là cứng nhắc và hoàn toàn khớp với sản phẩm thì sự khớp không hoàn toàn của phân tử cơ chất bây giờ ngăn cản phản ứng theo chiều xuôi. Nhu cầu đẩy nhanh tốc độ phản ứng enzim theo cả chiều thuận và chiều nghịch đạt được một cách hiệu quả nhất nhờ cấu trúc trung tâm hoạt động khớp hợp nhất với cấu trung gian giữa trạng thái cơ chất và sản phẩm. Ba mô hình chính được đưa ra để thỏa mãn nhu cầu này: (1) Mô hình khớp cảm ứng: do Koshland (1968) đưa ra, cho rằng trung tâm hoạt động của enzim là dễ thay đổi về mặt hình thể. Khi vắng mặt cơ chất, TTHĐ ở dạng không hỗ trợ cho xúc tác. Khi có một cơ chất tốt gắn vào TTHĐ, các lực liên kết giữa enzim và cơ chất được dùng để chuyển enzim về dạng cấu trúc phù hợp với năng lượng ít hơn nhưng lại có hoạt tính enzim cao hơn (mô hình giá đỡ dưới đây giải thích mô hình khớp cảm ứng). Trong mô hình này, một cơ chất “tồi” thiếu các đặc điểm cấu trúc cần thiết để gây ra sự thay đổi hình thái cần thiết cho hoạt tính xúc tác thì sẽ không thể xảy ra phản ứng. Hình 1: Mô hình giá đỡ của tương tác enzim – cơ chất và quá trình xúc tác 1. Enzim tự do và cơ chất tự do trong dung dịch; 2. Liên kết mở đầu cho sự hình thành phức hệ enzim cơ chất mà chưa gây ra sự xoắn vặn cấu trúc cơ chất; 3. Enzim trải qua sự thay đổi về mặt hình thể để tạo ra mối liên kết tốt hơn với cơ chất (khớp cảm ứng); 4. Enzim trải qua những điều chỉnh về mặt hình thể lớn hơn mà làm căng phân tử cơ chất bằng cách đó bẻ cong cơ chất từ dạng cấu trúc nền về cấu trúc ở dạng chuyển tiếp; 5. Sức căng cảm ứng trong 4 dẫn tới sự bẻ gãy liên kết và giải phóng 2 sản phẩn A và B. (2) Mô hình gắn không tạo sản phẩm: TTHĐ của enzim được cho là cứng nhắc, và một cơ chất tốt sẽ là cơ chất có một vài đặc điểm cấu trúc mà mỗi đặc điểm lại bổ sung với một tiểu trung tâm đặc trưng trong cấu trúc TTHĐ. Do sự có mặt của rất nhiều tương tác giữa các tiểu trung tâm bổ sung nên chỉ có một hình thái và một định hướng cơ chất trong trung tâm hoạt động của enzim. Một cơ chất “tồi” trong mô hình này sẽ có thể thiếu một hay nhiều nhóm chức năng chủ chốt cho việc liên kết chính xác. Hay nói cách khác, nhóm chức năng chủ chốt có thể có mặt trong một cơ chất tồi nhưng được sắp xếp theo một kiểu không phù hợp cho liên kết chính xác với TTHĐ của enzim; những quan điểm này được minh họa ở hình 2 dưới đây. Mô hình liên kết không tạo sản phẩm này thường được dùng làm dẫn chứng để giải thích hiện tượng ức chế cơ chất ở nồng độ cơ chất cao. Hình 2: Sơ đồ minh họa cho mô hình gắn không tạo sản phẩm Trong mô hình này, một cơ chất “tốt” có những nhóm đặc hiệu mà ăn khớp với các tiểu trung tâm của TTHĐ của enzim, qua đó thu được duy nhất một chiều liên kết tạo sản phẩm thuận lợi cho xúc tác. Một cơ chất “tồi” là cơ chất thiếu một chức năng giữ giúp định hướng cơ chất đúng vào vị trí TTHĐ. Khi đó cơ chất tồi có thể gắn theo rất nhiều hướng khác nhau mà chỉ có một chiều tạo ra xúc tác có hiệu quả. Các hướng khác, không tạo ra sản phẩm, làm ngăn cản xúc tác. (3). Mô hình căng cảm ứng: Trong mô hình này, các lực liên kết giữa enzim và cơ chất được dùng trực tiếp gây ra sức căng trên phân tử cơ chất, qua đó xoắn cơ chất về trạng thái chuyển tiếp tạo thuận lợi cho phản ứng xảy ra. Trong mô hình này, trung tâm hoạt động của enzim được coi là linh động. Hình thái bền nhất (VD: năng lượng thấp nhất) của TTHĐ của enzim là cấu trúc không phù hợp một cách tối ưu với cấu trúc cơ chất ở trạng thái nền, nhưng thay vào đó lại bổ sung với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Đối với cơ chất ở trạng thái nền, để liên kết, enzim phải trải qua một loạt biến đổi về hình thái mà không có lợi về mặt năng lượng. Do đó trong phức hợp ES sẽ có một lực đẩy phân tử enzim quay trở lại trạng thái năng lượng thấp hơn ban đầu và điều này đạt được kèm theo sự xoắn vặn phân tử cơ chất để đưa nó về cấu trúc ở trạng thái chuyển tiếp mà bổ sung đối với hình thể năng lượng thấp nhất (hình 3 dưới). Mới nhìn, mô hình này dường như giống mô hình khớp cảm ứng, trong đó, năng lượng gắn được sử dụng để đưa các nhóm phản ứng trong TTHĐ về đúng dạng sắp xếp như cơ chất tốt nhằm tạo ra tính đặc trưng cơ chất. Ngược lại, mô hình căng cảm ứng sử dụng năng lượng liên kết để trực tiếp làm giảm năng lượng tự do hoạt hóa cho phản ứng bằng cách cặp đôi xoắn vặn cơ chất và giãn hình thái có triển vọng về mặt năng lượng của phân tử enzim. Hình 3: Sơ đồ minh họa mô hình căng cảm ứng Enzim tự do 1 đang ở trạng thái năng lượng thấp nhất bổ sung tốt nhất với cấu trúc ở trạng thái chuyển tiếp của cơ chất. Dựa trên liên kết cơ chất này 2, enzim trải qua quá trình chuyển tiếp về hình thể để ăn khớp với cơ chất. Sức căng hình thể cảm ứng trong 2 là nhờ sự tạo thành trạng thái chuyển tiếp gắn trong 3. Khi đó, quá trình xúc tác dẫn tới sự tạo thành một phức hệ enzim – sản phẩm 4 trước khi sản phẩm giải phóng để tái tạo enzim tự do ban đầu. Các hiệu quả không gian không chỉ là cơ chế gây ra sức căng trong phân tử cơ chất liên kết. Các liên kết hidro, tương tác kị nước và các lực không cộng hóa trị khác có thể gây ra các tương tác không thích hợp choc ơ chất ở trạng thái nền mà thúc đẩy sự xoắn tới cấu trúc trạng thái chuyển tiếp, nơi mà những tương tác này là thuận lợi về mặt năng lượng. 4. Một vài nguyên lý giải thích khả năng xúc tác và tính đặc hiệu của enzim Có 2 nguyên lý cơ bản và liên hệ với nhau giải thích phương thức hoạt động của enzim Thứ nhất, khả năng xúc tác của enzim là do năng lượng tự do giải phóng khi hình thành các liên kết yếu và sự tương tác xảy ra giữa enzim và cơ chất của nó. Năng lượng liên kết này tạo ra tính đặc hiệu cũng như tính xúc tác của enzim Thứ hai, các tương tác yếu được tối ưu hóa trong trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Các trung tâm hoạt động của enzim không chỉ khớp với cơ chất mà còn khớp với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng nó xúc tác. * Enzim dùng năng lượng liên kết để xúc tác phản ứng tạo ra tính đặc hiệu phản ứng Năng lượng liên kết làm cho enzim có tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu chính là khả năng một enzim phân biệt được hai cơ chất cạnh tranh nhau. Về thuật ngữ, tính đặc hiệu khác xa với tính xúc tác, nhưng trên các thí nghiệm thì không đơn giản như vậy, bởi vì chúng cùng có các hiện tượng như nhau. Nếu trung tâm hoạt động của enzim có những nhóm chức được sắp xếp tối ưu để tạo ra hàng loạt các tương tác yếu với một cơ chất nào đó ở trạng thái chuyển tiếp thì nó không thể tương tác tốt với bất kì cơ chất nào khác. Ví dụ: nếu cơ chất bình thường có nhóm hydroxyl tạo thành liên kết hydro đặc hiệu với gốc Gl của enzim thì bất kì phân tử nào thiếu nhóm hydroxyl đặc hiệu đó sẽ là cơ chất tồi đối với enzim. Hơn nữa, nếu phân tử nào có thêm nhóm chức mà enzim lại không có vị trí liên kết với nhóm chức này thì phân tử này có thể bị loại bỏ khỏi enzim. Nhìn chung tính đặc hiệu khởi nguồn từ sự hình thành các tương tác yếu giữa enzim và một phần hoặc toàn bộ phân tử cơ chất đặc hiệu của nó. Enzim có thể tự thay đổi cấu hình khi cơ chất liên kết với nó, tạo ra nhiều tương tác yếu với cơ chất. Hiện tượng này gọi là khớp hợp cảm ứng, một cơ chế được Daniel Koshand đưa ra năm 1958. Khớp hợp cảm ứng sắp xếp các nhóm chức đặc hiệu của enzim vào vị trí đúng để xúc tác phản ứng. Sự thay đổi cấu hình cũng cho phép hình thành thêm các tương tác yếu ở trạng thái chuyển tiếp * Tương tác yếu giữa enzim và cơ chất được tối ưu hóa ở trạng thái chuyển tiếp Chúng ta xem xét một phản ứng tưởng tượng: phản ứng bẻ gẫy 1 thanh kim loại. Chúng ta xem xét 2 enzim tưởng tượng xúc tác cho phản ứng này, cả 2 đều có lực từ (thay cho năng lượng liên kết sử dụng bởi enzim thật). Đầu tiên chúng ta thiết kế một enzim khớp thật hoàn hảo với cơ chất (hình dưới). Để bẻ gãy thanh kim loại, phải đưa được thanh kim loại đến trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Thanh kim loại khớp chặt vào TTHĐ nên nó không thể cong, bởi vì khi nó cong, nó sẽ làm giảm tương tác từ giữa kim loại và enzim. Enzim như vậy ngăn cản phản ứng xảy ra và làm ổn định cơ chất. Khi biểu diễn trên sơ đồ phản ứng, phức hợp ES này tương đương với 1 giếng năng lượng mà rất khó để cơ chất có thể thoát ra được. Enzim này là vô ích. Mô hình hoạt động xúc tác của enzim được Haldane đưa ra lần đầu năm 1930, sau đó được phát triển bới Linus Pauling năm 1946. Để xúc tác phản ứng enzim phải bổ sung với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng, có nghĩa là sự tương tác tối ưu (dù chỉ là tương tác yếu) giữa cơ chất và enzim có thể chỉ xảy ra ở trạng thái chuyển tiếp. Trên hình dưới thanh kim loại ban đầu liên kết nhưng chỉ có một vài tương tác từ được dùng để tạo phức hợp ES. Cơ chất liên kết vẫn phải tăng năng lượng tự do cần thiết để đạt tới trạng thái chuyển tiếp. Tuy nhiên, sự tăng năng lượng để làm cong thanh kim loại và một phần bẻ cấu hình được bù đắp bằng tương tác giữa enzim và cơ chất ở trạng thái chuyển tiếp. Chính tương tác giữa enzim và các phần không phản ứng của thanh kim loại đã cung cấp năng lượng cần thiết để xúc tác bẻ gãy thanh kim loại. Hình 4: Enzim tưởng tượng (strickaza) được phác họa sự xúc tác bẻ gãy thanh kim loại (a) Sự bẻ gãy thanh kim loại trước hết phải uốn cong (Trạng thái chuyển tiếp); (b) Enzim với túi liên kết từ sự bổ sung trong cấu trúc với thanh kim loại (cơ chất) sẽ làm bền cơ chất này. Sự uốn cong bị cản trở bời sức hút giữa thanh kim loại và stickaza. (c) Sự bổ sung enzim vào trạng thái chuyển tiếp sẽ giúp cho sự loại độ bền của thanh kim loại, kết quả là xúc tác phản ứng. Sự tương tác này sẽ cung cấp năng lượng bù cho sự tăng năng lượng tự do đòi hỏi đối với sự uốn cong thanh kim loại. Kết quả là năng lượng hoạt hóa giảm đi rất nhiều (đồ thị bên cạnh) Enzim thực sự cũng hoạt động theo nguyên lý tương tự như vậy. Một số tương tác yếu được hình thành trong phức hợp ES nhưng phần lớn tương tác yếu được thiết lập giữa enzim với cơ chất khi ở trạng thái chuyển tiếp. Năng lượng tự do (năng lượng liên kết) giải phóng từ những tương tác này đã một phần bù lại năng lượng cần thiết để đạt tới đỉnh năng lượng. So với phản ứng không xúc tác, độ dốc có enzim xúc tác nhỏ hơn rất nhiều. Nguyên lý quan trọng ở đây là tương tác yếu giữa enzim và cơ chất tạo ra lực đẩy chính để xúc tác phản ứng. Các nhóm trên cơ chất tham gia vào tương tác yếu này thường nằm trên vị trí cách xa liên kết bị phá vỡ hoặc thay đổi. Những tương tác yếu hình thành ở trạng thái chuyển tiếp đóng vai trò chính vào hoạt động xúc tác. 5. Giảm năng lượng hoạt hoá Năng lượng hoạt hóa là năng lượng cần thiết để khởi đầu cho 1 phản ứng hoá học (thường là nhiệt) → enzim làm giảm năng lượng hoạt hoá của phản ứng hoá học bằng cách tạo nhiều phản ứng trung gian. Tốc độ của 1 phản ứng xảy ra chậm khi các chất tham gia phản ứng cần 1 lượng năng lượng hoạt hoá lớn và ngược lại → muốn tăng tốc độ phản ứng cần giảm năng lượng hoạt hoá. Trong tự nhiên năng lượng hoạt hoá thường là dạng nhiệt năng. Với thân nhiệt của người là 37 0C nếu không có enzim thì sự chuyển hoá vật chất không xảy ra được. Nếu theo nguyên lí vật lí và hóa học để có năng lượng hoạt hóa cho phản ứng hóa học phải tăng nhiệt độ và áp suất để làm tăng tốc sự vận động của chúng, và như thế làm tăng năng lượng động học và làm chúng dễ va chạm vào nhau. Còn enzim lại làm giảm năng lượng hoạt hóa bằng cách liên kết với cơ chất thay đổi hình thù để dễ tạo liên kết tạo điều kiện cho phản ứng xảy ra trong điều kiện và áp suất bình thường của cơ thể sống. Thông thường sự giảm năng lượng hoạt hóa dẫn tới sự tăng theo cấp số mũ tốc độ phản ứng. Enzim làm tăng tốc độ phản ứng hóa học bằng cách làm bền hóa trạng thái chuyển tiếp của phản ứng, từ đó làm giảm rào cản năng lượng hoạt hóa cho quá trình hình thành sản phẩm. * Các cơ chế để enzim làm giảm năng lượng hoạt hóa và tăng tốc phản ứng: - Khi chất tham gia phản ứng liên kết trong vùng trung tâm hoạt động của enzyme thì các chất được đưa vào gần nhau và định hướng sao cho chúng dễ dàng phản ứng với nhau. - Chất tham gia phản ứng khi liên kết với enzyme tại trung tâm hoạt tính có thể bị kéo căng hoặc vặn xoắn làm cho các liên kết trong phân tử dễ bị đứt gãy ở ngay nhiệt độ hoặc áp suất bình thường, tạo điều kiện hình thành liên kết mới. - Enzyme khi liên kết với cơ chất có thể chuyển một số nhóm chức sang cơ chất làm cho cơ chất chuyển sang trạng thái trung gian không ổn định. - Cấu trúc vùng trung tâm hoạt động có thể tạo ra vi môi trường có độ pH thấp hơn so với trong tế bào chất nên enzyme dễ dàng truyền H + cho cơ chất, một bước cần thiết trong quá trình xúc tác. 6. Sự điều hòa hoạt động của enzim Bằng nhiều cơ chế: - Sự định khu và phân bố hoạt động của enzim: Mỗi enzim được định khu và phân bố hoạt động đúng vị trí cần thiết. + Các enzim hoạt động ngoại bào, ví dụ enzim pepsin trong dạ dày. Đây là enzim ngoại bào, nhưng tế bào chỉ sản sinh enzim này ở dạng tiền enzim là pepsinogen không có hoạt tính và chỉ khi được tiết vào dạ dày nơi có pH = 2 thì mới chuyển thành dạng hoạt tính. + Trong tế bào nhiều enzim được phân vùng hoạt động bằng cách định khu bao gói lại. VD các enzim thủy phân trong lizoxom. Nếu màng lizoxom bị hỏng, các enzim được giải phóng ra tế bào chất, chúng sẽ phân hủy toàn bộ tế bào (trường hợp tự tiêu hoặc bệnh lí) + Nhiều enzim hoạt động theo dây chuyền được sắp xếp trật tự trên các màng nội bào. VD enzim trong màng của ti thể và lục lạp. - Điều hòa hoạt động theo mối liên hệ ngược: Nhiều enzim hoạt động phối hợp theo kiểu dây chuyền nối tiếp nhau. Các sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối cùng của dây chuyền sẽ là nhân tố hoạt hóa hoặc kìm hãm các enzim của phản ứng trước đó hoặc sau đó của dây chuyền. - Điều hòa dị hình không gian: Là điều chỉnh cấu hình không gian của trung tâm hoạt động thông qua trung tâm điều chỉnh bằng cách liên kết với các nhân tố điều chỉnh. V. CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI HOẠT TÍNH CỦA ENZIM Hoạt tính của enzim: được xác định bằng lượng sản phẩm được tạo thành từ một lượng cơ chất / một đơn vị thời gian. 1. Nhiệt độ Nhiệt độ cung cấp năng lượng cho phản ứng xảy ra. Ta đã biết rằng tốc độ của một phản ứng hóa học thông thường gấp đôi khi ta tăng nhiệt độ lên khoảng 10 0C. Hầu hết các chất xúc tác hóa học đều thể hiện sự tăng hoạt tính như vậy khi tăng nhiệt độ và các enzim cũng không phải ngoại lệ. Mỗi enzim có một nhiệt độ tối ưu, tại đó enzim có hoạt tính tối đa làm cho tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất. Đa số enzim hoạt động ở nhiệt độ tối ưu từ 40 – 450C, đối với động vật nhiệt độ tối ưu là nhiệt độ cơ thể; đối với một số thực vật và vi khuẩn enzim có nhiệt độ tối ưu cao, ví dụ ở cây đu đủ enzim papaya có nhiệt độ tối ưu đạt tới 650C, ở vi khuẩn cổ ưa nhiệt là 90 – 1000C. Khi nhiệt độ tăng quá cao so với nhiệt độ tối ưu thì sự tăng nhiệt độ làm tốc độ phản ứng giảm dần cho tới khi mất hoàn toàn hoạt tính (điểm D). Đa số enzim nhiệt độ điểm D là 600C. Do ở nhiệt độ cao protein bị biến tính nên trung tâm hoạt động của enzim bị biến đổi không khớp được với cơ chất nên không xúc tác được nữa. Enzim bị làm lạnh không mất hẳn hoạt tính mà chỉ giảm hay ngừng tác động. Khi nhiệt độ ấm lên enzim lại hoạt động bình thường. Đặc biệt ở vùng băng giá Nam cực và Bắc cực enzim của một số loài cá hoạt động ở - 20C. Ở giới hạn nhiệt độ của cơ thể sống tác động của enzim tuân theo định luật Vanhôp: Trong giới hạn nhiệt độ thích hợp, nếu nhiệt độ tăng lên 10 0C thì tốc độ phản ứng tăng gấp đôi cho đến khi đạt nhiệt độ tối ưu (điểm K). 2. Độ pH Quan trọng đối với hoạt tính của các amino acid tại vị trí hoạt động của enzym, góp phần thay đổi tốc độ phản ứng. Giống như tất cả các protein, các enzim có cấu trúc bậc 3 nguyên thể tương đối nhạy cảm với pH, sự biến tính xảy ra tại các giá trị pH cực cao hay cực thấp. Mỗi enzim hoạt động tối ưu trong pH thích hợp (đa số từ 6 – 8), một số enzim hoạt động ở pH = 2 (VD: pepsin,renin), hoặc pH kiềm mạnh (VD: enzim trong ruột non) Ta thấy cấu hình enzim có thể được duy trì qua một dải pH tương đối rộng, có thể lên tới 4- 5 đơn vị. Tuy nhiên trong dải pH này vận tốc enzim sẽ thay đổi theo pH. Hoạt tính enzim cao nhất ở độ pH tối ưu, khi độ pH tối ưu thay đổi sẽ dẫn đến kìm hãm hoặc phá hủy enzim. Các enzim hoạt động trong môi trường axit thường phải có các chuỗi axit amin để duy trì được các liên kết ion và liên kết Hydro. Liên kết tĩnh điện có trong prôtêin enzim thường do các gốc axit amin tích điện ngược dấu như axit glutamic (-) và lizin (+) tạo thành. Liên kết này rất nhạy cảm với nồng độ ion H+. Trong dung dịch càng có nhiều ion H+ thì phân tử enzim tích điện âm càng ít và tích điện dương càng nhiều. 3. Nồng độ cơ chất Tăng xác suất va chạm hiệu quả giữa cơ chất và enzym. Yếu tố này bị chi phối bởi cơ chế chuyển dịch cân bằng Le Chaterier. Với một lượng enzim xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch thì lúc đầu hoạt tính enzim tăng dần lên nhưng đến một lúc nào đó sự gia tăng nồng độ cơ chất không làm tăng hoạt tính của enzim vì các trung tâm hoạt động của enzim đã bão hòa cơ chất. 4. Nồng độ enzim: Với một lượng cơ chất xác định, khi nồng độ enzim càng cao thì hoạt tính của enzim càng tăng. 5. Chất ức chế hoặc hoạt hoá enzim: có thể làm tăng hay ức chế hoạt tính của enzim. a) Các chất ức chế: Có các chất ức chế cạnh tranh và các chất ức chế không cạnh tranh. Các chất ức chế cạnh tranh: là những chất có cấu trúc và hình dạng tương tự cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của E chiếm chỗ kết hợp của cơ chất → làm giảm số lượng phân tử enzim kết hợp với cơ chất. VD: xucxinat đehiđrogennaz là enzim chuyển hoá axit xucxinic, chất kìm hãm cạnh tranh với nó là axit malonic. Vì chất ức chế cạnh tranh có thể gắn vào cùng một ví trí trên enzym với cơ chất và đó là phản ứng thuận nghịch, do vậy nó có thể bị chiếm chỗ khi tăng nồng độ cơ chất. Chất ức chế cạnh tranh làm tăng Km nhưng không thay đổi Vmax. Các chất ức chế không cạnh tranh: Chất này kết hợp với enzim ở chỗ khác với trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzim theo hướng không có lợi cho hoạt tính xúc tác làm giảm tốc độ phản ứng. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm không cạnh tranh, E vẫn có thể kết hợp với cơ chất tạo thành phức EIS. Các chất ức chế không cạnh tranh thường là các ion kim loại nặng như Hg 2+, Ag2+. Chất ức chế không cạnh tranh không thể bị thay thế và không liên quan tới sự thay đổi nồng độ cơ chất.Chất ức chế không cạnh tranh, do vậy làm giảm V max nhưng không ảnh hưởng đến Km. Nhiều chất độc như các muối arsen hoặc xianit có tác động như thế. b) Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá: Các chất này có bản chất hoá học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp. VD tác dụng của anion clo, brom, iot đến hoạt tính của α – amilaza động vật; tác dụng của một số ion kim loại như Mn2+, Zn2+… đối với hoạt tính của các proteaza. Hiện tượng kháng thuốc trừ sâu ở nhiều loài côn trùng: có khả năng tiết enzim phân giải thuốc trừ sâu → tăng cường sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh. V. VAI TRÒ CỦA ENZIM TRONG QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA VẬT CHẤT - Enzim xúc tác các phản ứng sinh hoá trong tế bào. - Kiểm soát các phản ứng hóa học đặc biệt: Nhờ có tính đặc thù cao nên enzim kiểm soát được các phản ứng hóa học đặc biệt và điều chỉnh tốc độ phản ứng tương ứng với điều kiện trao đổi chất của cơ thể. - Tế bào tự điều hoà quá trình chuyển hoá vật chất thông qua điều khiển hoạt tính của enzim bằng các chất hoạt hoá hay ức chế. Tế bào là hệ thống mở tự điều chỉnh nên tế bào và cơ thể chỉ tổng hợp và phân giải chất cần thiết. -Ức chế ngược là kiểu điều hòa trong đó sản phẩm của con đường chuyển hóa quay lại tác động như một chất ức chế làm bất hoạt enzim xúc tác cho phản ứng ở đầu con đường chuyển hóa. Vai trò xúc tác của enzim là rất quan trọng. Khi enzim nào đó trong tế bào không được tổng hợp hoặc bị bất hoạt thì sản phẩm không tạo thành và cơ chất của enzim đó cũng sẽ tích luỹ gây độc cho tế bào hay gây các triệu chứng bệnh lí. CHƯƠNG II. MỘT SỐ BÀI THỰC HÀNH VỀ ENZIM I. Tính đặc hiệu của enzim 1. Thí nghiệm: Tính đặc hiệu của enzim Ureaza a) Chuẩn bị - Ureaza (bột đậu tương), dung dịch urê 5%, dung dịch acetamit 5% - Ống nghiệm, pipet, giấy quỳ, nút bấc ống nghiệm, tủ ấm 370C b) Cách tiến hành - Lấy 2 ống nghiệm sạch, cho vào ống A: 4ml urê 5%m ống B: 4ml acetamit 5% - Thêm vào mỗi ống 1g bột đậu tương, lắc đều. - Đặt trên miệng mỗi ống một mẩu giấy quỳ, đậy miệng 2 ống bằng nút bấc - Có thể đặt cả 2 ống vào 370C trong 5 – 10 phút, - Quan sát sự đổi màu của giấy quỳ và giải thích? c) Kết quả và giải thích Ureaza được xem là có tính đặc hiệu tuyệt đối: chỉ tác dụng lên ure, ngoài ra hầu như không tác dụng lên các hợp chất khác. Do tính đặc hiệu của Ureaza nên ở ống A có xảy ra phản ứng tạo NH 3, làm giấy quỳ chuyển sang xanh, còn ống B không xảy ra phản ứng. 2. TN về tính đặc hiệu của enzim α –amilaza nước bọt và saccarozơ nấm men a) Chuẩn bị - Nguyên liệu, hoá chất: dung dịch iôt 0,3%, HCl 5%, nước bọt, dung dịch saccarozơ nấm men, dung dịch tinh bột 1%, saccarozơ 4%, thuốc thử Lugol, thuốc thử Phêlinh. - Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn và diêm, máy li tâm, tủ ấm, lọc đựng hoá chất, giấy lọc. b) Cách tiến hành: - Lấy 4 ống nghiệm: + Cho vào ống 1 & 2 mỗi ống 1ml tinh bột 1%, ống 3 & 4 mỗi ống 1 ml saccarôzơ 4%. + Thêm vào ống 1 & 3 mỗi ống 1 ml nước bọt pha loãng 2 - 3 lần, thêm vào ống 2 & 4 1 ml dung dịch saccaraza nấm men. + Đặt 4 ống nghiệm vào tủ ấm ở 400C trong 15 phút. + Sau đó, lấy ra cho thêm ống 1 & 2 mỗi ống 3 giọt thuốc thử Lugol, cho thêm vào ống 3 & 4 mỗi ống 1 ml thuốc thử Phêlinh, đun trên ngọn lửa đèn cồn cho đến sôi. - Quan sát màu sắc các ống nghiệm và giải thích. c) Thu hoạch: Làm bảng tường trình về KQ TN theo các yêu cầu trong bảng Bảng 2: Thí nghiệm về tính đặc hiệu của enzim Ống 1 Cơ chất Enzim Thuốc thử Kết quả Ống 2 Ống 3 Ống 4 Kết quả thí nghiệm Bảng 2: Thí nghiệm về tính đặc hiệu của enzim Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Cơ chất Tinh bột Tinh bột Saccarôzơ Saccarôzơ Enzim Amilaza Saccaraza Amilaza Saccaraza Thuốc thử Lugol Lugol Phêlinh Phêlinh Kết quả Màu của thuốc Màu xanh tím Màu của thuốc Kết tủa đỏ thử Lugol thử Phelinh gạch Giải thích: Enzim đã phân hủy cơ chất nên cho thuốc thử vào thì không màu. Enzim và cơ chất không phù hợp nên cho thuốc thử vào đã xuất hiện màu=> Enzim có tính đăc hiệu. - α –amilaza chỉ thủy phân liên kết α –1,4-glycozit, trong khi Saccaraza chỉ thủy phân liên kết α –1,2-glycozit của đường saccarôzơ - Ống 1 và 2: α –amilaza nước bọt thủy phân liên kết α –1,4-glycozit ở amilozơ của tinh bột (thành phần tạo phản ứng màu với I 2 trong thuốc thử Lugol) thành glucozơ, trong khi Saccaraza không thủy phân được tinh bột. Do đó ống cho màu của thuốc thử Lugol (âm tính), trong khi ống 2 cho màu xanh tím (dương tính). - Ống 3 và 4: amilaza không thủy phân được saccarôzơ, còn Saccaraza thủy phân liên kết α –1,2-glycozit của đường saccarôzơ tạo thành glucozơ có tính khử. Do đó ống C âm tính với thuốc thử phêlinh, còn ống D xuất hiện kết tủa Cu 2O đỏ gạch (dương tính) II. Tính chất của enzim 1. TN về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đối với hoạt tính của enzim amilaza a) Chuẩn bị Dung dịch saccaraza nấm men: cân 1g men bia nghiền với 10 ml nước cất, để 30’ rồi li tâm hoặc lọc bằng giấy lọc. b) Cách tiến hành: - Lấy 4 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dd hồ tinh bột 1%: + Ống 1: Đun cách thủy. + Ống 2: Cho vào tủ ấm 400C. + Ống 3: Đặt trong nước đá. + Ống 4: Nhỏ vào 1ml dd HCl 5%. - Sau 5 phút, cho vào mỗi ống nghiệm 1ml amilaza (nước bọt pha loãng). Sau đó, để nhiệt độ phòng 15phút. - Dùng dd Iốt 0,3 % (hoặc thuốc thử Lugol) để xác định mức độ thủy phân tinh bột ở 4 ống. Quan sát màu sắc của các ống nghiệm và giải thích. c) Thu hoạch: Theo mẫu bảng