Tài liệu Chọn chủng vi khuẩn chế tạo và sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida và streptococcus suis gây ra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -----------
----------- NGUYỄN THỊ NGỌC BÍCH CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CHẾ TẠO VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida VÀ Streptococcus suis GÂY RA” LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI – 2012 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu tôi ñược tham gia thực hiện tại Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y. Các số liệu, kết quả ñược nêu trong luận văn là chính xác, trung thực và khách quan. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc Bích Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… i LỜI CẢM ƠN ðế hoàn thành luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi luôn ñược sự giúp ñỡ của nhà trường, bạn bè ñồng nghiệp. Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ quý báu của: - PGS. TS. Cù Hữu Phú, người hướng dẫn khoa học trực tiếp ñã giúp ñỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo ñiều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn này. - PGS. TS. Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; khoa Sau ñại học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñó tận tình giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. - Toàn bộ các cô, các anh, các chị trong Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia và ñặc biệt là gia ñình, cơ quan nơi tôi công tác ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc Bích Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt trong báo cáo vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình ix 1. ðẶT VẤN ðỀ................................................................................................................i 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI.........................................................................1 1.2. MỤC ðÍCH CỦA ðỀ TÀI......................................................................................2 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI ................................2 1.4. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................................................................2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................................3 2.1. VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE VÀ BỆNH VIÊM PHỔI MÀNG PHỔI..................................................................................3 2.2.VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG LỢN........................................................................................................10 2.3. VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ BỆNH DO LIÊN CẦU KHUẨN GÂY RA Ở LỢN.................................................................................17 2.4. HIỂU BIẾT CHUNG VỀ VACXIN....................................................................23 3. NỘI DUNG, ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU28 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................................................28 3.1. NỘI DUNG...............................................................................................................28 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iii 3.2. ðỐI TƯỢNG...........................................................................................................28 3.3. ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU .......................28 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................30 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...................................................38 4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ðƯỢC CHỌN CHẾ VACXIN............38 4.1.1. Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của 10 chủng A.pleuropneumoniae phân lập ñược ..................................................................38 4.1.2. Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của các chủng P.multocida phân lập ñược........................................................................................................39 4.1.3. Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Streptococcus suis phân lập ñược .......................................................................41 4.2. KẾT QUẢ XÁC ðỊNH SEROTYP CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN A.PLEUROPNEUMONIAE, P.MULTOCIDA VÀ S.SUIS PHÂN LẬP ðƯỢC.....................................................................................................................42 4.2.1. Kết quả ñịnh typ vi khuẩn Actinobacillus, Pasteurella phân lập ñược........42 4.2.2 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng Streptococcus suis phân lập ñược bằng phương pháp huyết thanh học và PCR...................................................44 4.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA ðỘC LỰC CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP ðƯỢC ..................................................................................................................................46 4.3.1. Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn P.multocida phân lập ñược............46 4.3.2. Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae phân lập ñược ........................................................................................................................47 4.3.3. Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng vi khuẩn Streptococcus suis Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iv phân lập ñược:.......................................................................................................48 4.4. KẾT QUẢ CHẾ TẠO VACXIN VIÊM PHỔI LỢN......................................50 4.4.1. Kết quả kiểm tra ñậm ñộ vi khuẩn của canh trùng dùng chế vacxin thử nghiệm ....................................................................................................................50 4.4.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của canh trùng chế tạo vacxin51 4.4.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin ................................................52 4.4.4. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của vacxin trên ñộng vật thí nghiệm ....................................................................................................................53 4.4.5. Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin phòng bệnh viêm phổi trên lợn.......55 4.4.6. Kết quả xác ñịnh ñộ dài miễn dịch của vacxin phòng bệnh viêm phổi trên lợn...........................................................................................................58 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ.......................................................................................64 5.1. KẾT LUẬN..............................................................................................................64 5.2. ðỀ NGHỊ..................................................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................66 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO A.pleuropneumoniae Actinobaccillus pleuroneumoniae AGID Agargel Immuno Diffuse BHI Brain Heart Infusion CAMP Chiristie – Atkinson – Munch – Peterson DNA Deoxyribonucleic Acid DNT Dermonecrotic Toxin ELISA Enzyme – linked Immunosorbant assay LD50 50 percent Lethal Dose LPS Lypopolysaccaride LTA Lipoteibic acid MR Methyl red NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide P.multocida Pasteurella multocida PCR Polymerase Chain Reaction S.aureus Staphylococcus aureus S.suis Streptococcus suis TCN Tiêu chuẩn ngành TSA Tryptic Soy Agar TYE Tryptone Yeast Extract Broth VP Voges – Prokauer THB Todd Herwitt Broth Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh serotype A, B, D của vi khuẩn P.multocida 31 Bảng 3.2 Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn Streptococcus suis 32 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn A.pleuropneumoniae phân lập ñược 39 Bảng 4.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn P.multocida phân lập ñược 40 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của các chủng S.suis phân lập ñược 41 Bảng 4.4 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng vi khuẩn A.pleuropneumoniae và P.multocida phân lập ñược sử dụng chế vacxin 43 Bảng 4.5 Kết quả xác ñịnh serotype của 1 số chủng vi khuẩn S. suis phân lập ñược*45 Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn P.multocida phân lập ñược Bảng 4.7 47 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập ñược 48 Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng vi khuẩn S.suis phân lập ñược trên chuột bạch Bảng 4.9 49 Kết quả ñếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng chế vacxin thử nghiệm Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của canh trùng chế tạo vacxin Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 52 51 vii Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng 3 lô vacxin chế thử nghiệm 52 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin trên chuột nhắt trắng 53 Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 54 Bảng 4.14 Tổng hợp kết quả công cường ñộc cho lợn sau khi tiêm vacxin 56 Bảng 4.15 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 1 tháng 59 Bảng 4.16 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 2 tháng 60 Bảng 4.17 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 3 tháng 61 Bảng 4.18 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 4 tháng 62 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Sơ ñồ tóm tắt quy trình chế tạo vacxin viêm phổi lợn 34 Hình 4.1: Kết quả của phản ứng PCR ñịnh type vi khuẩn P.multocida 44 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… ix 1. ðẶT VẤN ðỀ 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI Những năm gần ñây, ngành chăn nuôi ñược ñặc biệt quan tâm và có nhiều ñổi mới ñể hòa nhập với ngành chăn nuôi thế giới. Khi nói ñến chăn nuôi, trước tiên phải kể ñến chăn nuôi lợn bởi tầm quan trọng chăn nuôi rộng lớn, ý nghĩa thiết thực của thịt lợn và các sản phẩm ña dạng ñược chế biến từ lợn ñối với ñời sống kinh tế xã hội của nhân dân. Hàng loạt các vấn ñề về quản lý, kinh tế, di truyền chọn giống, kỹ thuật chăn nuôi lợn ở nước ta ñã và ñang ñược các nhà khoa học nghiên cứu giải quyết nhằm tiến kịp trình ñộ chăn nuôi lợn ở các nước trong khu vực và thế giới. Song trong quá trình chuyển dịch cơ cấu sản xuất: từ sản xuất phân tán nhỏ lẻ tiến tới sản xuất hàng hóa theo hướng tập chung trang trại ñã dẫn ñến nhiều nguyên nhân gây bệnh cho ñộng vật, nhiều loại hình dịch bệnh ñã xảy ra, trong ñó bệnh ở ñường hô hấp khá phổ biến. Hội chứng hô hấp ở lợn do nhiều nguyên nhân gây ra và ñã chết lợn với tỷ lệ không nhỏ hoặc có thể trở thành bệnh mạn tính hoặc với các thể nhẹ hơn trên nhiều lứa lợn, lây lan mạnh, ảnh hưởng tới sự tăng trọng kém tiêu tốn thức ăn cao hay tăng giá thành do việc dùng thuốc ñể ñiều trị hoặc vacxin ñể phòng bệnh. Bệnh này lại rất ña dạng, triệu chứng bệnh khác nhau, chính vì vậy ñể xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh cho lợn nuôi tại các khu vực khác nhau ở nước ta hiện nay là rất cần thiết. Một số vi khuẩn thường xuyên cư trú ở ñường hô hấp trên của lợn như: Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis, khi sức ñề kháng của cơ thể giảm sút (ñiều kiện môi trường, vệ sinh, chăm sóc kém) các vi khuẩn này tăng cường về số lượng và ñộc lực phát thành bệnh gây thiệt hại cho ñàn lợn. Biện pháp phòng chống bệnh hô hấp ở lợn, bệnh viêm phổi ở lợn có hiệu quả nhất vẫn là sử dụng vacxin phòng bệnh. ðể ñánh giá hiệu lực của vacxin ñược chế từ các chủng vi Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 1 khuẩn phân lập ñược từ lợn mắc bệnh là vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Chọn chủng vi khuẩn chế tạo và sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra”. 1.2. MỤC ðÍCH CỦA ðỀ TÀI Xác ñịnh hiệu lực và ñộ dài miễn dịch của vacxin chế tạo từ vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis phân lập ñược ñể phòng bệnh viêm phổi lợn. 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI Kết quả nghiên cứu là cơ sở ñể xây dựng quy trình bảo quản và sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra. ðồng thời cũng là cơ sở khoa học và thực tế giúp cho người chăn nuôi lợn nước ta sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn có hiệu quả cao nhất. 1.4. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi lợn. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE VÀ BỆNH VIÊM PHỔI MÀNG PHỔI 2.1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae Vi khuẩn A.pleuropneumoniae là một tác nhân gây bệnh viêm phổi màng phổi ở lợn. Bệnh có phân bố rộng rãi và ngày càng trở nên quan trọng do việc chăn nuôi lợn ngày một phát triển. Vi khuẩn A.pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước ñây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae ñã ñược chứng minh là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn. Vi khuẩn A.pleuropneumoniae là loại cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước 0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm, không di ñộng, không sinh nha bào và có hình thành giáp mô. Dưới kính hiển vi ñiện tử quan sát thấy vi khuẩn có lông hay còn gọi là pili có kích thước 0,5-2 x 60-450 nm. A.pleuropneumoniae là một vi khuẩn khó tính, khó nuôi cấy. Vi khuẩn phát triển trong môi trường nuôi cấy ñược bổ sung 5% huyết thanh ngựa và trong ñiều kiện có 5 - 10% CO2. Vi khuẩn không mọc trên môi trường thạch máu thông thường, trừ khi thạch máu ñược bổ sung NAD (Nicotinamid adenine dinucleotit) và chúng mọc xung quanh các khuẩn lạc của tụ cầu là do Staphylococcus aureus trong quá trình phát triển trên thạch máu ñã phá hủy hồng cầu có trong máu và sản sinh ra chất NAD. Trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn ñòi hỏi yếu tố V ñể phát triển, nó phát triển tốt trên môi trường thạch Chocolate, vi khuẩn không mọc trên môi trường MacConkey. Vi khuẩn A.pleuropneumoniae có khả năng lên men các loại ñường: Xylose, Ribose, Glucose, Fructose, Maltose,...và không lên men: Trehalose, Arabinose, Lactose, Raffinose,…. Phản ứng sinh Indol, Catalasa, Ureaza, CAMP Test dương tính. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 3 A.pleuropneumoniae có sức ñề kháng kém. Vi khuẩn chỉ tồn tại trong môi trường tự nhiên trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên khi ñược bảo vệ bởi chất nhầy hoặc các chất hữu cơ khác thì vi khuẩn có thể sống sót trong vài ngày. Trong nước sạch ở nhiệt ñộ 40C, vi khuẩn có thể sống ñược 30 ngày, nhiều giờ trong khí dung và có thể tồn tại ñược trong 4 ngày ở mô phổi và chất thải ở nhiệt ñộ phòng. Nó bị diệt nhanh chóng ở nơi khô và các chất sát trùng. A.pleuropneumoniae ñược chia thành 2 biotype dựa trên nhu cầu sử dụng NAD của vi khuẩn (Pohl và cs, 1983). Biotype 1 của vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo phụ thuộc vào NAD, biotype 2 không phụ thuộc vào NAD nhưng cần có các pyridine nucleotide ñặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotide ñể tổng hợp NAD cần thiết cho sự phát triển của chúng. Biotype 1 có ñộc lực cao hơn biotype 2. Trong biotype 1, có 12 serotyp ñược tìm thấy và ñược phân loại theo typ huyết thanh từ 1 - 12 (riêng serotyp 5 ñược chia làm 5A và 5B). Trong biotype 2, serotyp 2, 4, 7 và 9 có chung nhóm quyết ñịnh kháng nguyên như biotype 1. Gần ñây biotype 2 có serotyp 13, 14 ñược mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1. * Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố ñộc lực của vi khuẩn: - Lớp vỏ vi khuẩn: Vi khuẩn A.pleuropneumoniae ñược bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các polysaccharide. ðây là thành phần quyết ñịnh ñộc lực của vi khuẩn và gây hiệu ứng cho serotype ñặc hiệu (Ward and Inzawa, 1997). Lớp vỏ này không chỉ có ý nghĩa trong quá trình gây bệnh mà còn có ý nghĩa chẩn ñoán và dịch tễ (Inzama, 1991). Sự khác nhau về ñộc lực liên quan ñến cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và nội ñộc tố tạo nên (Dubreuil và cs, 2000). Quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử thấy những chủng có ñộc lực thì có kích thước lớn hơn và có lớp vỏ bám dính hơn trong khi những chủng ít ñộc thì nhỏ hơn và chỉ có lớp vỏ mỏng (Steffens và cs, 1990; Inzana, 1991). Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 4 Jacques và cs (1987), cũng xác ñịnh sự ña dạng trong cấu trúc vỏ khi phân tích lớp vỏ ở các serotyp 1 - 10 dưới kính hiển vi ñiện tử và cho thấy lớp vỏ dày khoảng 80 - 90mm ñến 210 - 230mm tùy từng serotyp. Chính ñiều này ñã giải thích cho sự khác nhau về ñộc lực giữa các serotyp. Lớp vỏ giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi sự ñề kháng của ñộng vật như hoạt ñộng thực bào và hoạt ñộng bổ thể. Những chủng có vỏ ñề kháng với hoạt ñộng tiêu diệt của bổ thể ñã ñược chứng minh. Những thể ñột biến không có vỏ sẽ bị tiêu diệt ngay sau khi có mặt huyết thanh, trong khi những chủng có vỏ thì không (Ward và Inzana, 1997). - ðộc tố của vi khuẩn: ða số các chủng A.pleuropneumoniae ñều tạo ra 1 hoặc nhiều hơn 1 ñộc tố phân hủy hồng cầu. Phân tích những ñộc tố hồng cầu này quan sát thấy chúng là 1 protein hạt nhân của RTX (Repeat in Toxin), ñược tìm thấy ở hầu hết các vi khuẩn Gram (-) như E.coli, B.pertussin, M.haemolytica. Ở A.pleuropneumoniae, ñộc tố này gọi là ñộc tố Apx ñược xác ñịnh là Apx I, Apx II, Apx III (Frey, 1995) và Apx IV (Cho và Chae, 2001b). Người ta xác ñịnh chắc chắn về vai trò của Apx trong quá trình gây bệnh của A.pleuropneumoniae. Mỗi ñộc tố này khác nhau do hoạt ñộng phân giải hồng cầu gây ñộc tế bào (Frey và cs, 1993). - Lipopolysaccarit: Lipopolysaccarit (LPS) là thành phần chính của lớp màng ngoài vi khuẩn và ñược cho là nguyên nhân gây tổn thương mô. Những tổn thương do LPS tinh chế không gây xuất huyết, không gây hoại tử khác với tổn thương ñặc trưng của viêm phổi - màng phổi. Song LPS chắc chắn kết hợp với ñộc tố Apx làm tăng ñộc lực và làm tăng ñộc tính cho ñộc tố Apx. LPS có vai trò quan trọng trong sự bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô và lớp màng nhầy khí quản của lợn. Bám dính là hoạt ñộng ban ñầu giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn và có thể là ñặc tính gây bệnh, là nguyên nhân gây ra bệnh. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 5 2.1.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra Bệnh viêm phổi truyền nhiễm của lợn do A.pleuropneumoniae gây ra ñã xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới. Tại Việt Nam trong những năm gần ñây, A.pleuropneumoniae ñã ñược phân lập và ñược ñánh giá là một vi khuẩn gây nên một bệnh hô hấp khá quan trọng ở tất cả các trại lợn siêu nạc quy mô lớn. Tất cả các lứa tuổi lợn ñều bị cảm nhiễm. Trong trường hợp cấp tính của bệnh thì tỷ lệ chết thường cao. Tỷ lệ chết cũng phụ thuộc vào ñộc lực của vi khuẩn và sự lưu hành bệnh trong môi trường. Bệnh nặng hơn và tỷ lệ tử vong cao hơn nếu nhiễm kế phát các bệnh khác như bệnh Aujeszky và hội chứng hô hấp sinh sản ở lợn (PRRS) (Pol và cộng sự, 1997). - Triệu chứng lâm sàng: Triệu chứng lâm sàng có nhiều mức phụ thuộc vào tuổi của gia súc, tình trạng miễn dịch, ñiều kiện môi trường và mức ñộ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh. Biểu hiện lâm sàng của bệnh có thể là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính. + Thể quá cấp tính: một hoặc nhiều lợn cai sữa cùng một chuồng hoặc khác chuồng bị ốm nặng, sốt tới 41,50C, ñờ ñẫn, không muốn ăn, nôn mửa và ỉa chảy, con vật bị bệnh nằm trên nền chuồng, không có dấu hiệu thở rõ ràng, mạch ñập tăng lên rất sớm và trụy tim mạch. Da trên mũi, tai, chân và sau cùng là toàn bộ cơ thể trở nên tím tái ở giai ñoạn cuối và chết. + Thể cấp tính: nhiều lợn ở 1 chuồng hoặc ở những chuồng khác nhau cùng mắc bệnh. Lợn sốt cao từ 40,5 - 410C, da ñỏ, con vật mệt mỏi, không muốn dậy, không ăn uống. Các dấu hiệu hô hấp nặng với khó thở, ho và ñôi khi thở bằng mồm trở nên rõ. Thường xuất hiện trụy tim mạch, với xung huyết ở các ñầu tứ chi. Toàn thân suy sụp trong vòng 24 giờ ñầu, bệnh diễn biến khác nhau ở từng con vật, phụ thuộc mức ñộ tổn thương phổi và thời ñiểm bắt ñầu ñiều trị. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 6 + Thể bán cấp và mãn tính: xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính biến ñi. Không sốt hoặc sốt ít, xuất hiện ho tự phát hoặc thỉnh thoảng, với các cường ñộ khác nhau. Có thể súc vật kém ăn, giảm tăng trọng, có thể xác ñịnh các gia súc bị ốm bằng dấu hiệu các con vật này không gắng sức ñược. Khi di chuyển, chúng thường ñi lùi lại phía sau và khi bị chặn lại chúng thường ít chống cự. Ở các ñàn gia súc bị nhiễm mãn tính thường có nhiều súc vật bị nhiễm không biểu hiện rõ trên lâm sàng. Các dấu hiệu lâm sàng có thể trở lên rõ hơn bởi sự kết hợp với các yếu tố gây nhiễm trùng ñường hô hấp khác (Mycoplasma, vi khuẩn, virus). Các biến chứng như viêm khớp, viêm nội tâm mạc và apxe ở các vị trí khác nhau có thể xảy ra cùng với nhiễm trùng A.pleuropneumoniae. - Bệnh tích: Tổn thương bệnh lý ñại thể chủ yếu ở ñường hô hấp. ða số các trường hợp bị viêm phổi hai bên, với tổn thương ở các thùy ñỉnh và thùy tim, cũng như ít nhất một phần các mỏm trên của thùy hoành và ở ñó viêm phổi thường khu trú, ranh giới rõ. Ở các trường hợp tử vong nhanh chóng, khí quản và các phế quản bị lấp ñầy bởi các chất tiết nhầy bọt nhuốm máu. Có thể thấy một số tổn thương ñại thể ở các trường hợp tối cấp tính, các vùng viêm phổi trở nên sẫm màu và chắc, với viêm màng phổi có ít tơ huyết hoặc không tơ huyết và mặt cắt thường mủn. Viêm màng phổi tơ huyết thường rất rõ ở các gia súc chết trong giai ñoạn cấp tính của bệnh ít nhất 24 giờ sau khi nhiễm trùng và khoang màng phổi chứa dịch nhuốm máu. Khi tổn thương tiến triển lớn hơn, viêm màng phổi tơ huyết trên vùng phổi tổn thương trở nên xơ và có thể dính rất chặt màng phổi vào thành ngực tới mức làm cho phổi dính vào thành ngực ngay cả khi mổ lợn chết lấy phổi ra phân tích. Tổn thương sớm ở phổi là phổi trở nên ñỏ tím hoặc ñen ñồng ñều và sau ñó trở nên sáng hơn và sau ñó vẫn cứng ở những khu vực bị nặng nhất. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 7 Các tổn thương kích cỡ co lại khi bệnh giảm, ở trường hợp mãn tính còn tồn tại các nốt kích thước khác nhau, phần lớn ở thùy tim. Những nốt dạng apxe ñược giới hạn bởi vỏ dày tổ chức liên kết và có lẽ kết hợp với khu vực viêm phổi tơ huyết. Trong một số trường hợp khi tổn thương phổi ñược phục hồi thì chỉ còn lại một số ổ di chứng của viêm dính màng phổi tơ huyết. Tỷ lệ lưu hành bệnh viêm màng phổi mãn tính cao ở lợn giết thịt có nghĩa là viêm phổi màng phổi nhiều. Trong các giai ñoạn ñầu của bệnh, những biến ñổi về tổ chức bệnh lý ñược ñặc trưng bởi sự hoại tử, xuất huyết, thâm nhiễm các tế bào bạch cầu trung tính, sự hoạt hóa ñại thực bào và tiểu cầu, nghẽn mạch máu, phù rộng và tiết dịch rỉ viêm lẫn fibrin. Sau phản ứng cấp tính ñặc trưng là sự thâm nhiễm ñại thực bào, xơ hóa rõ quanh những vùng hoại tử và viêm màng phổi fibrin. - Chẩn ñoán: Căn cứ vào triệu chứng lâm sàng kết hợp với các bệnh tích ở phổi và màng phổi cùng với sự nghiên cứu tổ chức học của các tổn thương. Vì tầm quan trọng của bệnh, nên cần xác ñịnh vi khuẩn học ñể khẳng ñịnh chẩn ñoán. Ở các ñộng vật mới chết dễ dàng tìm thấy căn nguyên bệnh tại phế quản hoặc dịch tiết ở mũi và tổn thương phổi. Việc khẳng ñịnh là A.pleuropneumoniae có thể có nhiều cách: bằng kháng thể huỳnh quang, bằng Peroxidase miễn dịch, bằng ñồng ngưng kết tìm kháng nguyên ñặc hiệu cho serotype ở chiết xuất tổ chức phổi, sử dụng ngưng kết latex hoặc ELISA. Có thể dùng kỹ thuật PCR hoặc test huyết thanh với kháng thể hấp thụ hoặc kháng thể ñơn dòng ñể xác ñịnh vi khuẩn phân lập ñược có phải là A.pleuropneumoniae không. Có thể xác ñịnh tới các serotyp bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR cho các gen hoạt hóa cấu trúc của ñộc tố hoặc có thể sử dụng kháng thể ñơn dòng với từng serotyp. Có thể xác ñịnh serotyp khi cho ngưng kết vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng với huyết thanh hoặc bằng phản ứng ñồng ngưng kết. Trong một số trường hợp dùng phương pháp khuếch tán trên thạch và phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 8 - ðiều trị: A.pleuropneumoniae trên ống nghiệm rất nhạy cảm với Penicilline, Ampiciline, Cephalosporin, Tetracycline, Colistin, Sulfonamide, Cotrimoxazole (Trimethoprim+ Sulfamethoxazole) và Gentamycine với nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC: ) thấp. Vi khuẩn này có MIC cao với Streptromycine, Kanamycine, Spectinomycin, Spiramycine và Lincomycine (Nicolet và Schifferli, 1982; Gilbride và Rosendal, 1984; Nadeau và cộng sự, 1988; Inoue và cộng sự 1984). Prescott và Baggot (1993) ñã thông báo về tính mẫn cảm của vi khuẩn này với các thuốc kháng sinh. Sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc với Ampicillin; Streptromycin, Sulfonamides, Tetracyclines và là vấn ñề ñáng lo ngại, thường gặp ở các serotyp 1, 3, 5 và 7 (Gilbride và Rosendal, 1984), nhưng hiếm gặp ở các serotyp khác, nhất là serotyp 2 (Nicolet và Schifferli, 1982; Inoue và cộng sự, 1984). Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn A.pleuropneumoniae truyền theo Plasmid. Kháng sinh ñược chọn lựa phải là kháng sinh có sự kháng kháng sinh thấp nhất và có ñặc tính diệt khuẩn ñược tốt nhất. Do vậy, các kháng sinh nhóm Betalactamin A (chủ yếu Cephalosporin), Cotrimoxazole và với một mức ñộ nhất ñịnh nào ñó, Tetracycline ñược coi là có tác dụng nhất. Một số kháng sinh mới có gần ñây như các dẫn xuất Quinolone (Enrofloxacine) hoặc Cephalosporin bán tổng hợp Ceftiofur sodium ñã ñược chứng minh trên thực nghiệm rất có kết quả. Người ta ñã thu ñược những kết quả tốt trên thực nghiệm khi dùng Tiamulin và hỗn hợp Lincomycine và Spectinomycine (Moore và cộng sự, 1996) ñã dùng Tilmicosin cho vào thức ăn. Do ñó cần làm kháng sinh ñồ khi thí nghiệm ñiều trị kháng sinh. ðiều trị kháng sinh chỉ có hiệu quả ở giai ñoạn ñầu của bệnh và phải dùng liều cao ngay từ ñầu. ðể ñảm bảo có nồng ñộ thuốc có hiệu quả ổn ñịnh Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 9 trong máu có thể cần tiêm nhiều lần, tùy theo ñặc tính mẫn cảm của thuốc sử dụng. Sự thành công của việc ñiều trị phụ thuộc chủ yếu vào việc phát hiện sớm các dấu hiệu lâm sàng của bệnh và can thiệp ñiều trị sớm. - Phòng bệnh: Có thể tiến hành phòng bệnh viêm phổi - màng phổi theo một số cách. Các trại không bị mắc bệnh và nhiễm khuẩn phải duy trì chính sách cách ly ñi ñôi với việc sử dụng tinh dịch hoặc bào thai ñể ñưa vào các gen mới. Khi nhập lợn mới nào vào ñàn thì con ñó phải xuất phát từ một ñàn không bị bệnh, không nhiễm vi khuẩn, nên cách ly chúng trong một thời gian trước khi cho chúng vào ñàn. Một khi ñã xuất hiện nhiễm trùng ở một trại khó có thể loại trừ tác nhân nhiễm trùng, mặc dù về lâm sàng ñàn gia súc có thể bình thường. Các chương trình kiểm soát phải tính ñến các ñặc ñiểm dịch tễ học của viêm màng phổi. Có thể dùng thuốc liên tục hoặc ngắt quãng, nhưng không bao giờ ñược dùng kéo dài và cần thường xuyên theo dõi sự mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh. Chỉ sử dụng kháng sinh cho lợn mới vào chuồng khi chúng ñược chuyển ñến từ các ñàn lợn không bị nhiễm khuẩn ñể tránh ñưa vào các serotyp mới hoặc kháng kháng sinh mới. Ở các ñàn bị nhiễm khuẩn mãn tính, cần tiêm chủng các con lợn mới mua có chẩn ñoán huyết thanh âm tính trước khi cho vào ñàn. ðã có nhiều loại vacxin ñược sản xuất cho bệnh này gồm 2 nhóm chính: Các vi khuẩn ñã chết (vacxin vô hoạt) và các vacxin với một số thành phần cấu tạo của vi khuẩn. Vacxin vô hoạt toàn khuẩn ñặc hiệu theo serotyp có thể có miễn dịch với các serotyp khác có phản ứng chéo. Song song với ñó phải tiến hành các biện pháp khử trùng. Vi khuẩn nhạy cảm với nhiều chất tiệt trùng thông thường. 2.2.VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG LỢN 2.2.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida Vi khuẩn P.multocida gây bệnh cho nhiều loài ñộng vật, mỗi một serotyp Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 10