Tài liệu Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ cặn chiết ethyl acetat vỏ quả cây bảy lá một hoa (paris polyphylla var. chinensis (franch.) h. hara) trồng ở lào cai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC NGUYỄN THỊ BƢỞI CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CẶN CHIẾT ETHYL ACETAT VỎ QUẢ CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara) TRỒNG Ở LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC Ngƣời thực hiện: NGUYỄN THỊ BƢỞI CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CẶN CHIẾT ETHYL ACETAT VỎ QUẢ CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara) TRỒNG Ở LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Ngƣời hƣớng dẫn: 1. 2. PGS.TS. ĐỖ THỊ HÀ PGS.TS. DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến Lãnh đạo, thầy cô Khoa Y – Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập, nghiên cứu, rèn luyện để hoàn thành chƣơng trình học tập suốt 5 năm qua và làm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đỗ Thị Hà, PGS.TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, ThS. Nguyễn Thị Duyên, những ngƣời đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới cán bộ nghiên cứu khoa Hóa thực vật – Viện Dƣợc liệu, lãnh đạo Viện Dƣợc liệu đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành thực nghiệm tại Viện. Tôi cũng xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài của Quỹ L'oreal National Fellowship – 2016 và một phần kinh phí từ đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis Smith) theo hƣớng hỗ trợ điều trị ung thƣ vú, 2017-2019”. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những ngƣời luôn luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Dù đã rất cố gắng, nhƣng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện của tôi còn hạn hẹp nên bài khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của các thầy cô để bài khóa luận của tôi đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Bƣởi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ý nghĩa Ký hiệu BLMH Bảy lá một hoa CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DCM Diclomethan EtOAC Ethyl acetat EtOH Ethanol GI50 Nồng độ ức chế 50% sự gia tăng tế bào HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử LD50 Nồng độ gây chết 50% đối tƣợng thử M Khối lƣợng phân tử (Mass) MeOH Methanol MS Phổ khối (Mass Spectroscopy) NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) PP Paris polyphylla PPC Paris polyphylla var. chinensis PPY Paris polyphylla var. yunnanensis SKLM Sắc ký lớp mỏng TGI Total growth inhibitor TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TT Thuốc thử UV Phổ tử ngoại (Ultra Violet) VKH&CNVN Viện khoa học và công nghệ Việt Nam v/v Thể tích/ Thể tích DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Paris L. ở Việt Nam ........................................... 3 Bảng 1.2. Các flavonoid đƣợc phân lập từ chi Paris ...................................... 10 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong vỏ quả PPC........... 27 Bảng 3.2. Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột phân đoạn EtOAc ....................... 30 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ của hợp chất 3 (500MHz-MeOD) và viniferin ........... 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của các saponin spirostan của chi Paris ............................. 6 Hình 1.2. Cấu trúc của các saponin furostan .................................................... 6 Hình 1.3. Cấu trúc của các saponin pregnan ..................................................... 7 Hình 1.4. Một số saponin steroid khác đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Paris .................................................................................................. 8 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các saponin triterpen ...................................... 9 Hình 1.6. Các bộ phận sinh dƣỡng và sinh sản của Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var. chinenis Franchet đƣợc trồng tại Sapa, Lào Cai .... 12 Hình 2.1. Mẫu quả Bảy lá một hoa thu hái tại Lào Cai. ................................. 18 Hình 2.2. Nguyên tắc sắc ký ........................................................................... 20 Hình 3.1. Sơ đồ chiết cao phân đoạn vỏ quả bảy lá một hoa .......................... 29 Hình 3.2. Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) của cao ethyl acetat. .............................................................................................. 29 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn PE phần vỏ quả..... 31 Hình 3.4. Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) cao phân đoạn EtOAc và các hợp chất phân lập đƣợc ................................... 32 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1-3 ........................................... 33 Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 .......................................................... 34 Hình 3.7. Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) của hợp chất 1 và chất chuẩn stigmasterol ................................................... 34 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 .......................................................... 35 Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất 2 ............................................................... 36 Hình 3.10. Phổ ESI-MS của hợp chất 3 .......................................................... 36 Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 ........................................................ 37 Hình 3.12. Phổ 13C-NMR (A) và HSQC (B) của hợp chất 3 .......................... 38 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. DANH MỤC BẢNG BIỂU .......................................................................................... DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN .....................................................................................2 1.1. 1.2. Tổng quan về chi Paris ..................................................................................2 1.1.1. Phân loại thực vật và phân bố chi Paris .................................................2 1.1.2. Đặc điểm thực vật ...................................................................................2 1.1.3. Thành phần hóa học chi Paris ................................................................3 1.1.4. Độc tính.................................................................................................11 Tổng quan về loài Bảy lá một hoa ...............................................................11 1.2.1. Vị trí phân loại và tên gọi .....................................................................11 1.2.2. Đặc điểm thực vật .................................................................................12 1.2.3. Sinh thái, phân bố .................................................................................13 1.2.4. Thành phần hóa học ..............................................................................13 1.2.5. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học .........................................................14 1.2.6. Cách trồng .............................................................................................16 1.2.7. Thu hái và chế biến ...............................................................................16 1.2.8. Công dụng và cách dùng .......................................................................16 CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................18 2.1. Đối tƣợng .....................................................................................................18 2.2. Hoá chất, trang thiết bị ................................................................................18 2.3. 2.2.1. Hoá chất ................................................................................................18 2.2.2. Thiết bị ..................................................................................................19 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................19 2.3.1. Định tính bằng phƣơng pháp hóa học ...................................................19 2.3.2. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc 19 CHƢƠNG 3 – THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................21 3.1. Định tính các nhóm chất ..............................................................................21 3.1.1. Đinh tính tanin ......................................................................................21 3.1.2. Định tính flavonoid ...............................................................................21 3.1.3. Định tính saponin ..................................................................................22 3.1.4. Định tính alcaloid..................................................................................22 3.1.5. Định tính glycosid .................................................................................23 3.1.6. Định tính coumarin ...............................................................................24 3.1.7. Định tính chất béo, caroten, sterol ........................................................25 3.1.8. Định tính đƣờng khử, acid amin, acid hữu cơ ......................................26 3.1.9. Định tính polysaccharid ........................................................................26 3.2. Chiết xuất .....................................................................................................28 3.3. Khảo sát và phân lập các hợp chất trong cao ethyl acetat ...........................29 3.4. 3.5. 3.3.1. Khảo sát bằng SKLM ...........................................................................29 3.3.2. Phân lập bằng phƣơng pháp sắc ký cột ................................................30 Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất đã phân lập đƣợc .................32 3.4.1. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập đƣợc 32 3.4.2. Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc ...............33 Bàn luận .......................................................................................................39 3.5.1. Về định tính ..........................................................................................40 3.5.2. Về chiết xuất .........................................................................................40 3.5.3. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất ...................40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. PHỤ LỤC ...................................................................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội phát triển, chất lƣợng cuộc sống ngày càng đƣợc cải thiện. Vì vậy nhu cầu chăm sóc sức khỏe đƣợc chú trọng hơn. Hiện nay để đáp ứng nhu cầu đó, lĩnh vực dƣợc phẩm phát triển không ngừng. Tận dụng những lợi thế về điều kiện tự nhiên và kinh nghiệm trong việc sử dụng những cây thuốc và động vật làm thuốc từ rất lâu. Nhiều dƣợc chất làm thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu nhƣ: rutin, berberin, taxol, artermisinin... Xu hƣớng nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên để phát triển nguồn tài nguyên dƣợc liệu theo hƣớng hiện đại ngày càng đƣợc chú trọng. Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinenis) và những loài khác cùng chi là những cây thuốc quý hiếm, thƣờng đƣợc sử dụng trong dân gian để tiêu sƣng nhọt, chữa rắn cắn…[6], từ lâu Trung Quốc đã sử dụng vị thuốc này để điều trị ung thƣ. Hiện nay, tác dụng dƣợc lý đặc biệt là tác dụng chống ung thƣ của Bảy lá một hoa đang đƣợc các nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu. Một số tác dụng dƣợc lý của loài Paris là tác dụng chống ung thƣ, điều hòa miễn dịch, cầm máu, chống oxy hóa, kháng virus, kháng nấm, chống ký sinh trùng, hạ sốt, giảm đau, an thần,….[1]. Về thành phần hóa học, các hợp chất đã phân lập đƣợc từ một số loài Paris là saponin, flavonol, sphingolypid và các glycosid khác [7]. Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của các bộ phận trên mặt đất, dƣới mặt đất, thân rễ, tuy nhiên chƣa có nghiên cứu về phần vỏ quả của Bảy lá một hoa. Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng nhƣ giá trị sử dụng của loài Paris polyphylla var. chinenis nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ cặn chiết ethyl acetat vỏ quả cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara) trồng ở Lào Cai” với mục tiêu phân lập và xác định cấu trúc 3 hợp chất hóa học từ cặn chiết ethyl acetat vỏ quả cây Bảy lá một hoa thông qua việc thực hiện các nội dung sau: - Định tính các nhóm hợp chất có trong vỏ quả bằng các phản ứng hóa học đặc trƣng. Chiết xuất và phân lập các hợp chất. Xác định và nhận dạng cấu trúc của một số chất phân lập đƣợc trong phân đoạn ethyl acetat. 1 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Paris 1.1.1. Phân loại thực vật và phân bố chi Paris Phân loại thực vật Hiện nay, hệ thống phân loại thực vật chi Paris chƣa có sự thống nhất. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris: Phân giới thực vật bậc cao Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Loa kèn (Lilidae) Bộ củ nâu (Dioscoreales) Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae) Chi Bảy lá một hoa, Tảo hƣu (Paris) [5] Phân bố Chi Paris là một chi nhỏ, phân bố ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Butan, Nê Pan, Pakistan, Mianma, Thái Lan), châu Âu và châu Mỹ [7]. Thực vật chí Trung Quốc đã mô tả hình thái và xếp chi Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài, 17 thứ, trong đó có 12 loài đặc hữu [20,26]. Ở Việt Nam, chi Paris hiếm gặp, phân bố chủ yếu ở một số tỉnh vùng núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên, theo Nguyễn Thị Đỏ nghiên cứu mô tả chi tiết và có khóa phân loại kèm hình ảnh về chi Paris L. có 6 loài theo bảng 1.1 [7]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây thảo nhiều năm; thân rễ thƣờng hình trụ, nạc, nằm ngang; phần thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh hoặc hiếm khi phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá mọc đối hoặc mọc vòng trên thân, 4 10 lá; phiến lá màu lục, có vệt tím hoặc không, hình mũi giáo, hình thuôn, hình trứng ngƣợc, mềm, gân bên rõ, không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn. Hoa thƣờng đơn độc hoặc một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lƣỡng tính, mẫu 3 5, cuống dài, thẳng đứng. Đài (2) 3 - 5 (10), rời nhau, hình mũi giáo, màu lục hoặc màu trắng, thƣờng to hơn cánh hoa, xếp lợp hoặc hơi vặn. Cánh hoa 2 (3) - 5 (10), dạng dải hoặc hình trứng, bằng nhau, màu sắc khác nhau. Nhị 3 - 22 chiếc, phần lớn 2 là 6 - 12; chỉ nhị dẹt, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình cầu hoặc hình sợi hoặc không kéo dài. Bầu thƣợng, tròn hoặc có cạnh, 3 - 12 lá noãn, nhiều ô, với kiểu đính noãn trung trụ hoặc 1 ô với kiểu đính noãn bên, mỗi bên nhiều noãn; vòi nhụy 3 - 5, rời hoặc dính nhau phần gốc; đầu nhụy 3 - 5. Quả mọng hoặc quả nang, mở ở lƣng ô. Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc không, nội nhũ rắn chắc hoặc nạc, chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [7]. Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Paris L. ở Việt Nam [6],[ 7] Loài Paris delavayi Franch. (Trọng lâu kim tiền) Paris polyphylla Smith. Phân bố Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo) Sơn La (Mộc Châu) (Trọng lâu nhiều lá) Paris dunniana Levl. Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Hải An), Vĩnh Phúc (Trọng lâu hải nam) (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phƣơng), Kon Tum (Kon Plong) Paris fargesii Franch. Sa Pa (Lào Cai) Paris chinensis Franch. (Bảy lá một hoa, Tảo hƣu) Paris yunnanensis Franch. (Trọng lâu vân nam) Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Nội (Ba Vì), Hoà Bình (Lƣơng Sơn, Mai Châu: Pà Cò) Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu (Phong Thổ) 1.1.3. Thành phần hóa học chi Paris Những nghiên cứu trong nƣớc Các công bố về thành phần hóa học chi Paris ở Việt Nam cho đến nay còn rất hạn chế. Năm 2015, Nguyễn Công Luận và cộng sự phân lập đƣợc 4 saponin 3 sterol từ thân rễ loài Paris yunnanensis thu thái tự nhiên tại Kon Tum là diosgenin, gracillin và hỗn hợp stigmasterol-3-O-β-D-glucosid và sistosterol-3-O-β-D-glucosid [10]. Những nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paris L. chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất tanin, flavonoid, acid phenolic, saponin [28,52], đƣờng [1], acid amin [45]. Trong đó thành phần chính là saponin steroid [40,54]. Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Paris bắt đầu từ năm 1938 bởi Dutt và cộng sự [19] phân lập đƣợc parid và paristyphnin từ loài P. quadrifolia. Sau đó năm 1983 Nakano [31] và Chen (1995) [17] công bố các hơp hợp chất saponin, flavonoid glycosid, sterol [14,18], β-phytoecdyson và polysaccharid đƣợc công bố lần lƣợt bởi Singh [42] và Zhou [53]. Cho đến nay có trên 55 saponin đƣợc phân lập từ 8 loài là: P. polyphylla var. yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis, P. delavayi Franch, P. vietnamensis, P. dunniana, P. luquanensis, Paris polyphylla var. pseudothibetica, P. quadrifolia. 1.1.3.1. Các hợp chất saponin a. Các hợp chất sapoin steroid  Các hợp chất saponin spirostan Các saponin này thƣờng có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin hoặc dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C-24 hoặc C-27. Các saponin này có từ 1 đến 4 đƣờng và thƣờng liên kết với phần aglycon tại C-3. Một số pennogenin saponin bị hydroxyl hóa tại vị trí C-23, C-24 và C-27 đƣợc phân lập bởi Chen và cộng sự [14,15,41] từ loài P. axialis và PPY. Các saponin spirotan (hình 1.1) đã phân lập đƣợc là: Diosgenin (1) phân lập từ thân và lá loài PPY [37] Trillin (2), Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glc (3) phân lập từ thân rễ PP [39], thân và lá PPY [37] Paris V (4) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân và lá PPY [37] Polyphyllin C (5) phân lập từ thân rễ PP [43] Diosgenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-β-D-Glc (6) phân lập từ thân rễ PP [31] Polyphyllin D/ Paris I (7) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân rễ PPY [47] 4 Dioscin/Paris III (8) phân lập từ thân rễ Paris axialis, thân lá PPY [16] Diosgenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-[α-L-Rha-(1→3)]-β-D-Glc (9) phân lập từ thân rễ PP [43] Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (10) phân lập từ loài PPC [49] Gracillin (11) phân lập từ loài PP [50], thân rễ PPY [47] Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (12) phân lập từ thân rễ PP [39] Paris II (13) phân lập từ thân rễ PP, thân và lá PPY [50] Polyphyllin F (14), Polyphyllin E (15) phân lập từ thân rễ PP [43] Diosgenin-3-O-β-D-Glc-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Rha-(1→3)]-β-D-Glc (16) phân lập từ thân rễ PP [50] Reclinatosid (17), Loureirosid (18) phân lập từ thân rễ PP [51] Diosgenin-3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)-β-D-Glc (19) phân lập từ thân rễ PPC [30] Diosgenin-3-O-β-D-Glc-(1→5)-α-L-Ara-(1→4)-[Rha(1→2)]-β-D-Glc (20) Paris IV (21) phân lập từ thân rễ, thân và lá PPY [50] Pennogenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-β-D-Glc (22) phân lập từ thân rễ PP [31] Paris H (23), Paris D (24) phân lập từ thân rễ PPC [30] Pennogenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Rha(1→2)]-β-D-Glc (25) phân lập từ hạt PPY [14] Pennogenin-3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)- β-D-Glc (26) Paris VII (27) phân lập từ phần trên mặt đất PPY, lá và thân rễ PPC [18] Polyphyllosid (28) phân lập từ thân rễ PP [50] Pennogenin-3-O-β-D-Api-(1→3)-[α-L-Rha-(1→2)]-β-D-Glc (29) phân lập từ thân rễ PPY [47] Pennogenin-3-O-β-D-Glc-(1→5)-α-L-Rha-(1→4)-[Rha(1→2)]-β-D-Glc (30) phân lập từ thân rễ PPY [47] 5 Hình 1.1. Cấu trúc của các saponin spirostan của chi Paris  Các saponin furostan Hình 1.2. Cấu trúc của các saponin furostan Các saponin furostan có cấu trúc tƣơng tự nhƣ các saponin spirostan nhƣng bị phản ứng của enzym mở vòng ở vòng F và bị đƣờng hóa tại C-26. Cấu trúc dạng này lần đầu tiên phân lập từ Paris bởi Matsuda và cộng sự năm 2003 [29] là protogracillin. Ngoài ra một số saponin furostan có thể chứa C-20 không no tại khung E. Các saponin furostan (hình 1.2) đã phân lập đƣợc là: 6 (25R)-26-O-β-D-Glc-22-hydroxy-5-en-furost-3β,26-diol-3-O-α-L-Rha(1→2)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (31) phân lập từ cây Paris quadriforia L. [33] Parisaponin I (32) phân lập từ thân rễ PP [29] Parisyunnanosid A (33), Th (34), Pseudoproto-Pb (35), Parisyunnanoside B (36) phân lập từ thân rễ PP [51]  Các saponin pseudo-spirostanol và pregnan Chen và cộng sự lần đầu tiên phân lập đƣợc hai nhóm saponin pseudospirostanol và pregnan từ chi Paris, trong đó nhóm saponin pseudo-spirostanol (1995) [17] gồm nuatigenin và isonuatigenin, năm 1990 công bố nhóm saponin pregnan [14,18]. Các saponin pregnan (hình 1.3) đã công bố gồm: Pregna-5,16-dien-3-ol-20-on-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→4)]-β-D-Glc (37) [14] Hypoglaucin H (38) phân lập từ lá PPY [37] Chonglouosid SL-7 (39), Chonglouosid SL-8 (40) phân lập từ thân và lá PPY [36] Hình 1.3. Cấu trúc của các saponin pregnan  Các saponin sterol khác Năm 2009, Xiao và cộng sự phân lập đƣợc parispseudosid A và parispseudosid B (41) [48]. 26-O-β-D-Glc-(25R)-Δ(5,6),(17,20)-dien-16,22-dion- 7 cholestan-3β,26-diol-3-O- α-L-Ara-(1→4)-[α-L-Rha-(1→2)]-β-D-Glc (42) đƣợc phân lập từ thân rễ PP [51]. Hợp chất 18-norspirostanol đƣợc phân lập từ loài P. quadrifolia bởi Nohara năm 1982 [33]. Năm 2016 Qin và cộng sự [35] đã phân lập đƣợc hai sterol là 7α-hydroxy stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (43) và 7βhydroxy sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44). Hình 1.4. Một số saponin steroid khác đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Paris b. Các saponin triterpen Theo Wu và cộng sự [47] đã lần đầu tiên phân lập đƣợc 15 saponin triterpenoid từ phần thân rễ loài PPY (hình 1.5) trong đó 6 hợp chất saponin oleanoid là mới (45-60) và 9 hợp chất còn lại đã biết cấu trúc gồm 3β,12αdihydroxyolean-28,13β-olid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (paristrisid A, 45), 3β,12α-dihydroxyolean-28,13β-olid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-β-D-Xyl (paristrisid B, 46), 3β-dihydroxyolean-11,13,(18)-dien-28-oic 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (paristrisid C, 47), 3β-dihydroxyolean-11,13,(18)-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Glc(1→2)-β-D-Xyl (paristrisid D, 48), 3β-hydroxyolean-18-dien-28-oic acid 3-O-β-DGlc-(1→2)-α-L-Ara (paristrisid E, 49), 3β-hydroxyolean-18-dien-28-oic acid 3-Oβ-D-Glc-(1→2)-β-D-Xyl (paristrisid F, 50), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (51), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-β-DGlc-(1→2)-β-D-Xyl (52), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-α-L-Ara (53), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Xyl (54), 3β-hydroxyolean-12-dien28-oic acid 3-O-β-D-Glc (55), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-α-L-Rha(1→2)-β-D-Glc (56), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O- β-D-Glc-(1→2)-β- 8 D-Glc (57), 3β,23-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid 3-O-β-D-Xyl-(1→2)-α-L-Ara (58), 3β,23-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (59). . Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các saponin triterpen 1.1.3.2. Các flavonoid Các flavonoid glycosides trong đó 6 chất có aglycon là kaempferol, 3 chất với aglycon là isorhamnetin, 1 quercetin đƣợc phân lập từ PPY và P.axialis [50]. Hầu hết đều là dạng O-glycosid. Hợp chất 65, 66 và 67 đƣợc phát hiện từ chi Paris bởi Wang. Trong đó hợp chất 69 đƣợc phân lập từ P. Mairei by Huang et al (bảng 1.2) [50]. 1.1.3.3. Phytosterols 71. R= H β-sitosterol 72. R= Glc Daucosterol 70. Stigmasterol Một số phytosterols chính chứa stigmasterol (70), β-sitosterol (71), và chất chuyển hóa của chúng trong chi Paris, Daucosterol (72) đƣợc phân lập từ P. delavayi bởi Liu et al [50]. 9 Bảng 1.2. Các flavonoid đƣợc phân lập từ chi Paris [50] Hợp chất R1 R2 R3 Tên gọi 60 Glc-(1→2)-Rha H H Kaempferol-3-O-α-L-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosid 61 Glc-(1→4)-Glc H H Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranoside 62 Glc-(1→2)-Rha Glc H 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)kaempferol-3-O-α-Lglucopyranosyl(1→2)-β-Dglucopyranosid 63 Glc-(1→6)-Glc H H Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid H 7-O-α-rhamnopyranosyl-kaempferol3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranosid 64 Glc-(1→6)-Glc Rha 65 Glc-(1→6)-Glc H OCH3 Isorhamnetin-3-O-β-gentiobiosid 66 Glc-(1→2)-Rha H OCH3 Isorhamnetin-3-O-β-D-runtinosid 67 Glc H OCH3 68 H H OH 69 H H H Isorhamnetin-3-O-β-Dglucopyranosid Quercetin Kaempferol 10 1.1.3.4. Các nhóm chất khác Một phenylpropanosid glycosid là parispolysid F (73) và một ramification của phenolic glycosid parispolysid G (74), một sphingolipid ethyl-α-Dfructofuranosid (75) và một glycosid (76) đƣợc phân lập từ PPY bởi Wang [50]. Ngoài ra, phân lập bằng CC phát hiện 18 acid amino [45]. 1.1.4. Độc tính Theo Danbensky, Stepven Clavey và cộng sự, Paris polyphylla có độc tính nhẹ, ở liều bình thƣờng gần nhƣ không có tác dụng phụ, ở liều cao (60 – 90 g) có phản ứng ngộ độc nhẹ, xuất hiện sau 1 – 3 giờ dùng thuốc. Biểu hiện: buồn nôn, nôn, ỉa chảy, hoa mắt chóng mặt, đau đầu, da mặt xanh tái, mắt mờ. Một số trƣờng hợp có thể gây co thắt, khó thở, loạn nhịp. Bột dƣợc liệu có thể gây kích ứng mũi và kết mạc mắt [10]. 1.2. Tổng quan về loài Bảy lá một hoa 1.2.1. Vị trí phân loại và tên gọi Bảy lá một hoa có tên khoa học là Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara. Tên đồng nghĩa là Paris chinensis Franchet, Paris formosana Hayata, 1911; Paris polyphylla auct. non Smith: Pei & Chou, 1964; Paris polyphylla ssp. polyphylla auct. non Smith: Phamh., 1993 [10,27]. Tên thông thƣờng là Tảo hƣu, Thất diệp nhất chi hoa, cúa dô (H’Mông) [1]. Tên nƣớc ngoài: Parisette, Herbe – Paris (Pháp) [1]. Họ Trọng lâu (Trilliaceae) [1,10]. 11 1.2.2. Đặc điểm thực vật Bảy lá một hoa là cây thảo nhiều năm, cao 40 - 100 (130) cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang, đƣờng kính khoảng 2 cm; thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá 5 - 6 (7), xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, hình trứng ngƣợc, hình thuôn, kích thƣớc 25 (27)  (5 – 7) cm, 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 (6) cm. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lƣỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, thẳng đứng. Đài 5 - 6 (7), dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thƣớc (3,5) 5 - 8 (9) × ((1) 1,5 - 2,5 (3,5)) cm, màu lục. Cánh hoa 5 - 6 (7), màu vàng, dạng dải, kích thƣớc ((3) 4,5 - 6 (7))  0,1 cm, bằng nhau. Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm. Bầu thƣợng, hình trứng, 4 - 5 lá noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu nhụy 5 – 6. Quả nang, mở ở lƣng ô. Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [7]. Hình 1.6. Các bộ phận sinh dƣỡng và sinh sản của Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var. chinenis Franchet đƣợc trồng tại Sapa, Lào Cai [11] A. Thân khí sinh mang lá và hoa; B. Một lá; C. Thân rễ; D. Lát cắt ngang thân rễ; E. Đài hoa; F. Cánh hoa; G. Nhị; H. Nhụy; I. Quả; K. Hạt 12