Tài liệu Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin peg để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh.pptx

Bộ Y tế Trường Đại học Dược Hà Nội CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP OXYTOCIN-PEG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH Người thực hiện: Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Rư HVCH. Lê Quang Nghị Nội dung 1 Đặt vấến đêề 2 Nguyên liệu và phương pháp 3 4 F Thực nghiệm và kêết quả Kêết luận và đêề xuấết 1. Đặt vấến đêề Đặt vấến đêề Oxytocin - Dêễ bị phấn hủy bởi enzym trong cơ thể - Kém ổn định trong bảo quản - Đặc điểm cấếu tạo - Vai trò - Sự kém bêền phấn tử Phương pháp tăng độ bêền ? Phương pháp pegyl hóa Tăng độ bền phân tử Tăng cường tác dụng Pegyl hóa Giảm tính sinh miễn dịch của protein đối với cơ thể Tăng thời gian bán thải Mục tiêu 1 Gắn kết được Oxytocin với phân tử polyehthylen glycol tạo phức hợp Oxytocin-PEG 2 Xác định hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu và phương pháp Nguyên liệu Hóa chấết Thiêết bị Oxytocin, methoxyl polyethylen glycol propion aldehyd 5kDa Kali dihyrophosphat, ethanol, Tris(methylen, aminopersulfat, natri dodecyl sulfat,… Máy khuấấy từ, điện di, buret, tủ lạnh, máy đo quang…. Phương pháp nghiên cứu  Gắấn PEG vào phấn tử Oxytocin - Dựa trên phản ứng khử - Dựa trên nghiên cứu của Jenifer Collin và công sự Đã thực hiện phản ứng liên hợp với Oxytocin với mPEG aldehyd. Xác định vị trí gắấn ở amin Cys 1. Phương pháp nghiên cứu  Xác định sự hình thành Oxytocin-PEG bắằng phương pháp điện di Điện di trên gel polyacrylamid có Natri dodecyl sulfat (SDS) Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp sắấc ký lọc gel Phương pháp nghiên cứu  Định lượng hợp chấất Oxytoicn-PEG bắằng phương pháp đo quang trực têấp - Chuẩn bị mấẫu chuẩn: Cchuẩn= 0,02 mg/ml - Chuẩn bị mấẫu thử: Gộp phấn đoạn thể tch Ve - Đo quang UV ở bước sóng 280 nm (mg/ml) Nôằng độ Cthử Oxytocin_PEG Lượng hợp chấất Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắấc ký lọc gel (mg) Hiệu suấất thu hôằi hợp chấất Oxytocin-PEG trong VR ml H% = 3. Thực nghiệm và kêết quả 3. Thực ngiệm và kêết quả 3.1 Găến PEG vào phấn tử Oxytocin • 8 mg Oxytocin • 1 ml dung dịch đệm phophat pH 4,5 • 40 mg mPEG aldehyd • 10 ml đệm phophat pH 4,5 • 250 mg NaCNBH3 khuấếy 15 phút Khuấếy trộn trong 1 giờ trước khi để phản ứng xảy ra ở 40C/24 giờ Tiêến hành tương tự dung dịch đệm pH 7,5 3.1 Găến PEG vào phấn tử Oxytocin 2 giai đoạn - Giai đoạn 1: ngưng tụ - Giai đoạn 2: khử hóa 3.1 Găến PEG vào phấn tử Oxytocin Hai mấễu phản ứng cho kêết quả tương tự - Không màu - Trong suôết. - Màu vàng nhạt - Trong suôết - Độ nhớt giảm 3.2 Xác định sự hình thành OxytocinPEG băềng điện di 1 2 3 1 2 3 Kếết quả điện di ở pH 4.5 Kếết quả điện di ở pH 7.5 Như vậy, trong mấẫu phản ứng có có sự xuấất hiện protein mới có khôấi lượng phấn tử khoảng 6 kDa. 3.3 Tách chiêết và xác định khôếi lượng phấn tử Oxytocin-PEG 01 Vẽẽ pick sắếc ký của Oxytocin và sản phẩm tạo thành trong quá trình pẽgyl hóa 02 Xấy dựng đường chuẩn vêề khôếi lượng phấn tử Kêết quả rửa giải trên cột săếc ký lọc gel của dung d ị ch Oxytocin 0.4 D 0.35 Oxytocin có 1 pick ở có đỉnh hấấp thụ cực đại ở V =18 ml. 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 ml Đồồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin.