Tài liệu Cấy mẫu phân

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau MAÃU PHAÂN Muïc tieâu · Höôùng daãn ñöôïc laâm saøng hay thöïc hieän hay laáy ñuùng maãu phaân laøm xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng phaùt hieän caùc taùc nhaân vi khuaån gaây beänh nhôø bieát ñöôïc caùc caùch laáy vaø chuyeân chôû maãu phaân. · thöïc hieän ñöôïc caùc qui trình vi sinh laâm saøng maãu phaân moät caùch chính xaùc vaø thích hôïp nhờ bieát ñöôïc qui trình thöïc hieän. · Löïa choïn ñöôïc phöông tieän thích hôïp nhaát cho caáy phaân trong caùc beänh vieän hieän nay nhôø bieát ñöôïc phöông tieän thích hôïp nhaát ñeå thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng maãu phaân. Chæ ñònh caáy phaân ¦ Chæ ñònh caáy phaân khi beänh nhaân bò tieâu chaûy hay bò caùc roái loaïn tieâu hoaù nghi do bò nhieãm truøng tieâu hoùa. ¦ Ñöùng tröôùc caùc beänh nhaân coù moät trong caùc trieäu chöùng sau ñaây, neân cho chæ ñònh caáy phaân: tieâu chaûy, lî vôùi phaân coù muû, nhaày hay maùu, bò côn ñau buïng. Thôøi ñieåm laáy phaân ¦ Neân laáy vaøo giai ñoaïn sôùm, caøng sôùm caøng toát cuûa beänh. ¦ Laáy phaân khaûo saùt tröôùc khi beänh nhaân duøng khaùng sinh. Caùch laáy maãu phaân ¦ Coù theå laáy phaân töôi, toát nhaát laø vuøng nhaày maùu, cho vaøo loï saïch; roäng mieäng; naép vaën chaët coù gaén maùi cheøo (duøng loï laáy maãu phaân khoâng F2M), göûi ñeán phoøng thí nghieäm. Phaân töôi phaûi ñöôïc caáy trong voøng khoâng quaù 2 giôø sau khi laáy maãu. ¦ Coù theå duøng taêm boâng nhuùng vaøo phaân, vuøng nhaày maùu, cho vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû Cary-Blair (duøng caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/tube ñuõa Cary-Blair) roài göûi ñeán phoøng thí nghieäm. Moâi tröôøng chuyeân chôû Cary-Blair coù theå giöõ maãu phaân trong hôn 48 giôø. Tuy 33 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau nhieân, phaûi tieán haønh caáy caøng sôùm caøng toát. Trong tröôøng hôïp nghi beänh nhaân bò thoå taû (do vi khuaån taû), coù theå cho taêm boâng laáy phaân vaøo oáng moâi tröôøng peptone kieàm ñeå vöøa taêng sinh, vöøa chuyeân chôû ñeán phoøng thí nghieäm. ¦ Coù theå laáy maãu phaân baèng taêm boâng queät haäu moân roài cho vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû (duøng caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/tube ñuõa Cary-Blair) ñeå göûi ngay ñeán phoøng thí nghieäm. ¦ Coù theå khoâng duøng moâi tröôøng chuyeân chôû neáu taêm boâng laáy phaân (duøng taêm boâng voâ truøng laáy maãu) ñöôïc nuoâi caáy trong voøng 30 phuùt sau khi laáy maãu. Khaûo saùt ñaïi theå Quan saùt maãu phaân vaø ghi nhaän: ¦ Loûng hay ñaëc? Coù nhaày, coù maùu khoâng? ¦ Maøu: traéng, vaøng, naâu ñen? Coù giun saùn khoâng? Khaûo saùt vi theå Chæ khaûo saùt vi theå caùc tröôøng hôïp sau: ¦ Laøm pheát soi töôi trong tröôøng hôïp nghi taû. ¦ Laøm pheát nhuoäm Gram trong tröôøng hôïp nghi taû vaø nghi Campylobacter jejuni. Nuoâi caáy ¦ ¦ Coù theå caáy phong phuù vaøo caùc moâi tröôøng - GN broth deå phong phuù caû Salmonella laãn Shigella. - Peptone kieàm ñeå phong phuù Vibrio. - Campy-thio ñeå phong phuù C. jejuni. Caáy ngay phaân, hay caáy töø moâi tröôøng phong phuù ñaõ caáy phaân vaøo caùc hoäp thaïch phaân laäp: - Toái thieåu laø MC (hay EMB) vaø SS (hay XLD hay HE). - Neáu coù yeâu caàu tìm Vibrio, caáy theâm leân MEA hay TCBS. - Neáu coù yeâu caàu tìm C. jejuni thì caáy theâm Campy-CAP. - Neáu nghi naám, caáy theâm thaïch Sabouraud. 34 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau ¦ Caùc hoäp thaïch phaân laäp phaûi ñöôïc uû 35-37oC trong tuû aám. Rieâng hoäp Campy-CAP thì uû vi hieáu khí trong nhieät ñoä 42oC. ¦ Quan saùt hoäp thaïch sau khi uû qua ñeâm, choïn khuùm vi khuaån nghi ngôø ñeå tieán haønh ñònh danh vaø laøm khaùng sinh ñoà. ¦ Ñoái vôùi caùc khuùm vi khuaån nghi ngôø Salmonella hay Shigella thì coù theå laøm phaûn öùng tuï vôùi khaùng huyeát thanh ñaëc hieäu ñeå ñònh nhoùm hay ñònh type. Caùc vi khuaån laø taùc nhaân gaây beänh tìm thaáy trong maãu phaân ¦ Caùc vi khuaån chaéc chaén gaây beänh: Salmonella, Shigella, caùc E. coli gaây beänh (ETEC, EPEC, EIEC, VETEC), S. aureus (coù enterotoxin), V. cholerae vaø caùc Vibrio khaùc, Campylobacter jejuni vaø caùc Campylobacter khaùc, Yersinia enterocolitica vaø caùc Yersinia khaùc, Clostridium difficile (coù toxin). ¦ Caùc vi khuaån coù theå gaây beänh: Plesiomonas, Aeromonas. Caùc vi khuaån khaùc coù theå gaây beänh neáu chieám ña soá do bò loaïn khuaån. Caâu hoûi oân taäp 1. Cho bieát caùc chæ ñònh ñeå caáy phaân. 2. Haõy cho bieát caùch laáy maãu phaân nhö theá naøo? 3. Haõy cho bieát phöông tieän ñeå laáy vaø chuyeân chôû maãu phaân thích hôïp nhaát cho caùc beänh vieän hieän nay, vaø phaân tích caùc öu khuyeát ñieåm cuûa caùc phöông tieän naøy. 4. Haõy cho bieát qui trình xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng thöïc hieän taïi phoøng thí nghieäm ñoái vôùi beänh phaåm phaân. 5. Haõy cho bieát caùc vi khuaån gaây beänh coù theå gaëp ñöôïc trong caáy phaân. 35 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau CAÁY PHAÂN – Caùc caâu hoûi thöôøng gaëp Phöông tieän naøo thích hôïp ñeå laáy vaø chuyeân chôû maãu phaân? ¦ Neáu laáy maãu phaân töôi thì toát nhaát laø duøng loï saïch coù maùi cheøo gaén treân naép ñeå laáy maãu. Cuõng coù theå duøng taêm boâng voâ truøng ñeå queät laáy maãu phaân. Maãu phaân töôi phaûi ñöôïc göûi ñeán phoøng thí nghieäm ñeå laøm xeùt nghieäm ngay vì neáu chaäm treã thì seõ laøm giaûm cô hoäi phaùt hieän caùc vi khuaån gaây beänh. ¦ Trong ñieàu kieän hieän nay, toát nhaát laø duøng caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/tube ñuõa CaryBlair ñeå laáy maãu phaân. Lyù do laø vôùi phöông tieän naøy, phoøng thí nghieäm coù theå ñeå doàn maãu laïi ñeå caáy vaøo cuoái ngaøy hay vaøo thôøi ñieåm thích hôïp nhaát trong ngaøy maø khoâng caàn phaûi caáy ngay moãi khi nhaän ñöôïc maãu. ¦ Traùnh duøng caùc loï penicillin röûa saïch, tube naép goøn vôùi taêm boâng töï quaán hay caùc loï nhöïa, huû thuyû tinh ñeå laáy maãu phaân vì nhö vaäy seõ khoâng an toaøn trong khaâu göûi maãu hay trong thao taùc xeùt nghieäm. Taïi sao ña soá caùc tröôøng hôïp tieâu chaûy xeùt nghieäm phaân thöôøng aâm tính? ¦ Coù theå beänh bò tieâu chaûy khoâng phaûi do vi khuaån maø do caùc nguyeân nhaân khaùc nhö do virus, do thaåm thaáu, do ñau bao töû, hay do caùc roái loaïn tieâu hoaù khaùc. Moät taùc nhaân virus thöôøng gaây tieâu chaûy laø Rota virus, vaø phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng coù theå phaùt hieän taùc nhaân naøy neáu coù phöông tieän sinh hoïc phaân töû (PCR, hay chæ caàn ly trích RNA toaøn phaàn roài ñieän di ñeå phaùt hieän 11 vaïch RNA ñaëc hieäu cuûa virus) hay mieãn dòch (tuï latex hay ñieän di mieãn dòch ñoái löu ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân ñaëc hieäu cuûa virus trong phaân). ¦ Coù theå beänh nhaân bò tieâu chaûy do caùc taùc nhaân vi khuaån ngoaøi khaû naêng phaùt hieän cuûa phoøng thí nghieäm do thieáu phöông tieän, hay do phoøng thí nghieäm khoâng coù kinh nghieäm ñeå phaùt hieän nhö E. coli (EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, VETEC), S. aureus tieát enterotoxin, maø muoán phaùt hieän chính xaùc phaûi coù theâm phöông tieän mieãn dòch hay sinh hoïc phaân töû; hay Campylobacter jejuni, Clostridium difficille, Y. enterocolitica, maø muoán phaùt hieän phaûi coù phöông tieän nuoâi caáy thích hôïp; Vibrio cholerae, Aeromonas, Plesiomonas maø muoán phaùt hieän thì phaûi coù kinh nghieäm hay phaûi coù quan taâm tröôùc. ¦ Cuõng coù theå do khoâng duøng ñuùng phöông tieän ñeå laáy vaø chuyeân chôû beänh phaåm, keùo theo haäu quaû laø vi khuaån gaây beänh khoâng coøn nhieàu trong beänh phaåm, hay do phoøng thí nghieäm 36 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau chaäm treã laøm xeùt nghieäm caùc maãu phaân töôi khoâng ñöôïc laáy vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû. Ngoaøi ra moät nguyeân do nöõa coù theå laø do phoøng thí nghieäm khoâng coù phöông tieän vi sinh toái thieåu ñeå phaân laäp vi khuaån gaây beänh trong maãu phaân cuõng nhö ñònh danh ñöôïc vi khuaån gaây beänh coù trong maãu phaân. ¦ Cuoái cuøng, coù theå do beänh nhaân ñaõ duøng khaùng sinh tröôùc khi laáy maãu neân khoâng theå caáy ñöôïc vi khuaån gaây beänh coù trong phaân, Vôùi qui trình xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng maãu phaân nhö ñaõ trình baøy, coù phaûi chuùng ta chæ phaùt hieän ñöôïc moät soá chöù khoâng phaûi taát caû caùc vi khuaån gaây beänh? ¦ Qui trình ñaõ trình baøy cho pheùp chuùng ta coù theå phaùt hieän haàu heát caùc vi khuaån gaây beänh keå caû C. jejuni vaø Vibrio spp. Chæ coù C. difficille, S. aureus sinh Enterotoxin vaø Y. enterocolitica laø khoâng theå phaùt hieän ñöôïc vì caàn phaûi coù theâm phöông tieän nuoâi caáy thích hôïp, tuy nhieân ñaây laø 2 taùc nhaân khoâng thöôøng gaëp. ¦ Vôùi C. jejuni, vì ñaây laø vi khuaån cuõng khaù thöôøng gaëp, do vaäy caùc beänh vieän cuõng neân quan taâm ñeå trang bò cho phoøng thí nghieäm phöông tieän nuoâi caáy phaùt hieän ñöôïc taùc nhaân naøy (xem phaàn kyõ thuaät phaân laäp C. jejuni). ¦ Vôùi caùc vi khuaån E. coli gaây beänh, ñeå phaùt hieän ñöôïc EPEC, phoøng thí nghieäm phaûi trang bò theâm boä khaùng huyeát thanh phaùt hieän (coù theå mua töø Biorad). Vôùi caùc E. coli khaùc nhö ETEC, EIEC, EHEC, VETEC thì neáu muoán phaùt hieän chính xaùc caàn phaûi coù theâm caùc phöông tieän mieãn dòch hay sinh hoïc phaân töû (PCR). ¦ Vôùi S. aureus sinh enterotoxin, ñeå phaùt hieän chính xaùc thì caàn phaûi coù theâm boä thuoác thöû ELISA phaùt hieän ñoäc toá hay phöông tieän sinh hoïc phaân töû phaùt hieän enterotoxin gene baèng kyõ thuaät PCR. ¦ Vôùi caùc phoøng thí nghieäm khoâng theå trang bò theâm caùc phöông tieän phaùt hieän chính xaùc E. coli, neáu khoâng phaùt hieän ñöôïc caùc taùc nhaân vi khuaån gaây beänh khaùc maø treân hoäp thaïch phaân laäp vi khuaån E. coli laïi chieám ña soá thì neân laøm khaùng sinh ñoà vi khuaån naøy ñeå traû lôøi keát quaû cho laâm saøng. ¦ Caùc vi khuaån khoâng gaây beänh ñöôøng ruoät nhö Proteus, Klebsiella, Pseudomonas... coù theå laø taùc nhaân gaây tieâu chaûy trong caùc tröôøng hôïp loaïn khuaån do vaäy vaãn neân laøm khaùng sinh ñoà vaø traû lôøi keát quaû cho laâm saøng neáu chieám ña soá treân hoäp thaïch phaân laäp vaø khoâng coù caùc vi khuaån gaây beänh khaùc. 37 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Hình 6: Loï laáy phaân töôi coù trang bò maùi cheøo gaén treân naép raát thuaän tieän cho beänh nhaân laáy phaân vaø naép vaën chaët traùnh nguy cô ræ phaân ra mieäng loï Hình 7: Loï laáy phaân khaûo saùt kyù sinh truøng coù tuùi F2M saün saøng ñeå duøng baûo quaûn phaân khaûo saùt kyù sinh truøng. Vôùi loï naøy chuùng ta coù theå löu maãu hôn 1 tuaàn. Hình 8: Caëp tube ñuõa taêm boâng voâ truøng/moâi tröôøng chyeân chôû Cary-Blair coù theå giuùp löu maãu phaân trong 48 giôø 38 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Sô ñoà 3: QUI TRÌNH VI SINH LAÂM SAØNG KHAÛO SAÙT MAÃU PHAÂN Phaân töôi Caáy ngay Cary-Blair D0 MT taêng sinh GN broth (peptone kieàm cho Vibrio, hay Campy-thio cho C. jejuni; neáu coù yeâu caàu ) Coù theå chôø ñeán chieàu UÛ 37oC/6-8h Moâi tröôøng phaân laäp 1. MC/EMB 2. SS/HE/XLD 3. (neáu coù yeâu caàu : TCBS, MEA cho Vibrio; Campy-BAP cho C. jejuni) UÛ 37oC/qua ñeâm. (Ñoái vôùi Campy-BAP thì uû vi hieáu khí 42oC vaø tieáp tuïc qui trình cho C. jejuni ) D1 Choïn khuùm VK nghi ngôø · khoâng leân men lactose · khuùm E. coli · khuùm öu theá Caáy taêng sinh leân BA/NA UÛ 37oC/töø saùng ñeán chieàu Khaùng sinh ñoà Ñònh type, group Ñònh danh KQ sô boä: type vaø group VK gaây beänh D2 KQ chung cuoäc Ñònh danh 39 KSÑ Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Kyõ thuaät phaân laäp Campylobacter jejuni Laáy maãu Maãu coù theå laáy töôi göûi ñeán phoøng thí nghieäm ñeå laøm xeùt nghieäm ngay. Neáu ñeå chaäm treã hôn 2 giôø thì maãu phaûi laáy vaøo moâi tröôøng chuyeân chôû/taêng sinh Campy-thio. Phaân laäp Campylobacter jejuni Coù theå caáy phaân laäp ngay, hay coù theå giöõ taêng sinh maãu trong Campy - thio ôû tuû aám 42oC trong 4 – 6 giôø roài môùi caáy phaân laäp. Coù hai caùch: ¦ Phaân laäp tröïc tieáp: Caáy beänh phaåm baèng phöông phaùp 3 chieàu treân moâi tröôøng Campy – BAP, roài uû hoäp thaïch trong moät bình uû kî khí (Genbox-anaer cuûa bio-Meùrieux) duøng bao sinh vi hieáu khí (Microanaer cuûa bio-Meùrieux). Giöõ bình trong tuû aám 42oC trong 24 ñeán 48 giôø. ¦ Phaân laäp qua loïc: Duøng moät loïc cellulose acetate 0.65mm voâ truøng ñaët treân maët hoäp thaïch Campy – BAP nhöng khoâng coù khaùng sinh. Duøng pipette Pasteur voâ truøng huùt beänh phaåm hay dung dòch taêng sinh beänh phaåm, nhoû 5 – 15 gioït leân taâm cuûa giaáy loïc. UÛ ngöõa hoäp thaïch trong tuû aám 37oC hay 42oC trong 1 giôø. Sau ñoù laáy tôø giaáy loïc ra khoûi maët thaïch, traùnh khoâng cho beänh phaåm nhoû tröïc tieáp leân maët thaïch. UÛ hoäp thaïch naày trong ñieàu kieän vi hieáu khí nhö treân. Ñònh danh Campylobacter jejuni ¦ Sau khi uû, quan saùt maët thaïch. C. jejuni cho khuaån laïc khaù tieâu bieåu: maøu xaùm nhaït hay xaùm vaøng nhaït, hôi nhaày, ñoâi khi coù ñuoâi theo ñöôøng caáy (hình 10). Kích thöôùc khaù lôùn: 1.5 – 2 mm. ¦ Nhuoäm Gram, vi khuaån aên maøu Gram [-], hôi nhoû, hình cong, coù theå thaáy daïng daëc tröng hình caùnh chim haûi aâu. Ñoâi khi coù hình daáu ngaõ (hình 9). ¦ Soi töôi qua kính hieån vi ñaûo phase hay neàn ñen, thaáy vi khuaån di ñoäng nhö teân baén. ¦ Thöû nghieäm oxidase [+], catalase [+] Hoäi ñuû ñöôïc caùc yeáu toá treân laø coù theå ñònh danh Campylobacter jejuni. 40 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Moâi tröôøng caàn thieát ñeå phaân laäp C. jejuni Dung dòch khaùng sinh 100X ¦ ¦ Coâng thöùc Vancomycin 100mg Trimethoprim 50mg Polymyxin B 25000UI Amphotericin B 20mg Cephalothin 150mg Nöôùc caát cho ñeán 100ml Voâ truøng qua loïc milipore. Phaân phoái vaøo caùc chai, moãi chai 2ml ñeå cheá 200 ml moâi tröôøng. Giöõ caùc chai trong tuû ñoâng –70oC Moâi tröôøng chuyeân chôû/taêng sinh Campy-thio ¦ Coâng thöùc Thioglycolate media 30gr Bacto agar 1.6gr Nöôùc caát 1000ml ¦ Ñun tan moâi tröôøng vaø agar, ñeå nguoäi, chænh pH ñeán 7.2. ¦ Phaân vaøo caùc chai Duran loaïi 250ml naép vaën chaët, moãi chai cho vaøo chính xaùc 200ml moâi tröôøng. Haáp khöû truøng 121oC/15 phuùt. Ñeå nguoäi, theâm vaøo moãi chai 2ml dung dòch khaùng sinh 100X ôû treân. Coù theå ñeå nguyeân chai trong tuû laïnh 4oC, hay phaân phoái voâ truøng 5ml Campy-thio vaøo caùc tube 15 x 125mm voâ truøng naép vaën chaët roài giöõ trong tuû laïnh 4oC (khoâng quaù 2 thaùng). Moâi tröôøng phaân laäp Campy-BAP ¦ Coâng thöùc Brucella agar base 43gr Nöôùc caát 1000ml ¦ Ñun tan moâi tröôøng vaø agar, ñeå nguoäi, chænh pH ñeán 7.2. ¦ Phaân vaøo caùc chai Duran 250ml naép vaën chaët, moãi chai 200ml moâi tröôøng. Khöû truøng baèng haáp öôùt 121oC/15 phuùt. Ñeå nguoäi ñeán 45oC, theâm vaøo moãi chai 10ml maùu cöøu ñaõ maát fibrin 41 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau vaø 2ml dung dòch khaùng sinh 100X ôû treân. Laéc nheï ñeå troän ñeàu, traùnh boït. Ñoå vaøo hoäp petrie voâ truøng loaïi 90 mm, moãi hoäp ñoå 18 – 20 ml moâi tröôøng. Chôø ñaëc laïi hoaøn toaøn. Giöõ caùc hoäp thaïch trong tuû laïnh (khoâng quaù 2 thaùng). Hình 9: Hình aûnh Gram vi khuaån Campylobacter jejuni Hình 10: Hình aûnh khuùm vi khuaån Campylobacter jejuni treân thaïch Campy-BAP 42