Tài liệu Cấy định lượng mẫu đờm

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau CAÁY ÑÒNH LÖÔÏNG MAÃU ÑAØM Muïc tieâu · Höôùng daãn laâm saøng cho ñuùng chæ ñònh caáy ñònh löôïng ñaøm maø khoâng phaûi quaù haïn cheá hay quaù roäng khoâng caàn thieát vì bieát ñöôïc caùc chæ ñònh laâm saøng ñeå cho laøm xeùt nghieäm caáy ñònh löôïng maãu ñaøm. · Thöïc hieän ñöôïc qui trình caáy ñònh löôïng maãu ñaøm trong phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng cuûa mình. · Trieån khai thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm caáy ñònh löôïng maãu ñaøm taïi beänh vieän khi coù yeâu caàu cuûa laâm saøng vi bieát vaø chuaån bi ñöôïc caùc phöông tieän caàn thieát vaø thích hôïp nhaát ñeå thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm naøy. Chæ ñònh Hieän nay coù moät xu höôùng môùi trong caáy ñaøm, ñoù laø caáy ñònh löôïng. Döïa vaøo keát quaû caáy ñònh löôïng coù theå phaân bieät taùc nhaân naøo laø taùc nhaân thaät söï gaây beänh coù trong maãu ñaøm, taùc nhaân naøo laø ngoaïi nhieãm vuøng haàu hoïng. Phöông phaùp caáy ñònh löôïng maãu ñaøm ñöôïc chæ ñònh thoâng thöôøng nhaát laø treân caùc vieâm phoåi naëng hay treân caùc vieâm phoåi beänh vieän. Treân vieâm phoåi coäng ñoàng thì khoâng nhaát thieát phaûi aùp duïng phöông phaùp naøy. Thôøi ñieåm laáy maãu vaø caùch laáy maãu Töông töï phöông phaùp caáy khoâng ñònh löôïng Ñaùnh giaù maãu ñaøm Tröôùc khi tieán haønh nuoâi caáy, maãu ñaøm cuõng ñöôïc ñaùnh giaù ñaïi theå vaø sau ñoù laøm moät pheát nhuoäm Gram ñeå ñaùnh giaù vi theå nhö phöông phaùp caáy ñaøm khoâng ñònh löôïng. Phöông phaùp caáy ñònh löôïng Tröôùc heát laøm tan ñaøm trong dung dòch nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng vöøa pha theâm NALC (SPUTAPREP-QT kit cuûa Nam Khoa) vaø sau ñoù pha loaõng ñaøm. Tieán haønh nhö sau: 90 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau ¦ Trong moät tube 15ml voâ truøng naép xanh (loaïi Falcon) ñaõ chöùa 10ml nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng (NS), cho theâm vaøo 50mg NALC (N-Acetyl-L-Cysteine), töùc laø toaøn boä boät NALC chöùa trong moät tube Eppendorf. Laéc nheï cho tan hoaøn toaøn. Dung dòch NS coù NALC naøy chæ duøng trong ngaøy vaø ñuû cho 2 – 3 maãu. Luoân luoân baûo quaûn tube dung dòch NALC ñaõ pha trong tuû laïnh 4oC. ¦ Laáy moät theå tích ñaøm caàn nuoâi caáy cho vaøo moät tube voâ truøng naép vaën chaët (hay loï voâ truøng naép ñoû). Theâm vaøo moät theå tích nhö vaäy dung dòch NS coù NALC vöøa môùi pha. Laéc nheï cho ñeán khi ñaøm tan trong dung dòch naøy. Nhö vaäy chuùng ta ñaõ coù ñaøm ñaõ pha loaõng 1/2. Sau khi ñaøm tan hoaøn toaøn, pha loaõng tieáp maãu ñaøm naøy thaønh 1/10 trong nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng. Nhö vaäy chuùng ta ñaõ coù ñaøm pha loaõng 1/20. ¦ Tieán haønh caáy ñònh löôïng maãu ñaøm ñaõ pha loaõng 1/2 treân caùc hoäp thaïch maùu cöøu (BA), thaïch naâu maùu ngöïa coù bacitracin (CAHI) vaø thaïch MC baèng khuyeân caáy ñònh löôïng 10ml (0.01ml) vaø 1ml (0.001ml) hay duøng micropipette ñeå huùt 10ml vaø 1ml caáy leân maët thaïch. Vôùi maãu ñaøm pha loaõng 1/20, duøng khuyeân caáy 1ml hay duøng micropipette ñeå huùt 1ml caáy leân maët thaïch vaø cuõng treân 3 loaïi hoäp thaïch nhö treân. Phöông phaùp caáy ñònh löôïng treân maët thaïch ñöôïc thöïc hieän nhö caáy ñònh löôïng nöôùc tieåu. Sau khi caáy, caùc hoäp thaïch BA vaø CAHI ñöôïc uû trong khí tröôøng CO2 coøn caùc hoäp thaïch MC ñöôïc uû trong khí tröôøng bình thöôøng, nhieät ñoä uû laø 35-37oC, thôøi gian uû qua ñeâm hay toái ña 24 giôø. Ñoïc keát quaû vaø ñònh löôïng caùc loaïi vi khuaån moïc treân caùc hoäp thaïch nhö trong baûng 4 trình baøy sau: Baûng 4: Caùch ñoïc keát quaû ñònh löôïng caùc loaïi vi khuaån trong maãu ñaøm döïa treân soá löôïng caùc loaïi khuùm vi khuaån moïc treân caùc hoäp thaïch. Hoäp thaïch Maãu ñaøm pha Voøng caáy ñònh Theå tích ñaøm Soá vi khuaån loaõng löôïng ñöôïc caáy ñöôïc ñònh löôïng 1 1/2 10ml 5ml 2N x 102/ml 2 1/2 1ml 0.5ml 2N x 103/ml 3 1/20 1ml 0.05ml 2N x 104/ml 91 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau 0.5ml 4.5ml NS voâ truøng N laø soá khuùm cuûa moät loaïi vi khuaån ñeám ñöôïc treân caùc hoäp thaïch. Ñeå coù con soá ñònh löôïng cuûa moät loaïi vi khuaån thì chuùng ta Ñaøm pha loaõng 1/2 trong dung dòch NALC Ñaøm pha loaõng 1/20 trong NS hay PBS neân laáy soá trung bình cuûa caùc keát quaû. Vd: ÖÙng vôùi caùc khuùm nghi 10ml ngôø K. pneumoniae, keát quaû treân MC1 10ml BA1 10ml CA1 hoäp thaïch MC1 laø 200 khuùm, löôïng vi khuaån K. pneumoniae 1ml MC2 trong 1ml ñaøm laø 40.000 CFU/ml 1ml BA2 1ml CA2 (2x200x102); treân hoäp thaïch MC2 1ml laø 15, löôïng vi khuaån/ml ñaøm laø MC3 3 1ml BA3 1ml CA3 30.000 CFU/ml (2x15x10 ); vaø treân hoäp thaïch MC3 laø 3, löôïng vi khuaån laø 60.000 CFU/ml (2x3x103). Nhö vaäy, keát quaû cuoái Sô ñoà 9: CAÙCH PHA LOAÕNG VAØ CAÁY ÑÒNH LÖÔÏNG MAÃU ÑAØM TREÂN CAÙC HOÄP THAÏCH cuøng löôïng vi khuaån K. pneumoniae trong maãu ñaøm seõ ñöôïc tính laø (40.000 + 30.000 + 60.000)/3 = 43.333 CFU/ml. Neáu caùc hoäp thaïch 1 vaø 2 coù vi khuaån quaù nhieàu (> 200 khuùm), chuùng ta chæ neân ñeám soá khuùm treân hoäp thaïch 3. Bieän luaän keát quaû Caùc vi khuaån coù löôïng ³ 1000 CFU/ml thì phaûi ñònh danh vaø khaùng sinh ñoà. Coù nghó laø tieán haønh ñònh danh vaø khaùng sinh ñoà baát cöù khuùm vi khuaån naøo moïc ñöôïc treân hoäp thaïch 2 vaø 3 hay coù soá löôïng ³ 5 khuùm treân hoäp thaïch 1. Traû lôøi laâm saøng caû keát quaû ñònh löôïng laø bao nhieâu vi khuaån ñaõ ñònh danh vaø laøm khaùng sinh ñoà ñeå laâm saøng coù theå tuyø nghi söû duïng. Caâu hoûi oân taäp 1. Cho bieát caùc chæ ñònh laâm saøng ñeå caáy ñònh löôïng maãu ñaøm. 2. Coù caàn ñaùnh giaù maãu ñaøm trong caáy ñònh löôïng khoâng? 3. Neâu cuï theå caùch caáy ñònh löôïng maãu ñaøm nhö theá naøo vaø veõ sô ñoà thöïc hieän. 4. Bieän luaän moät keát quaû caáy ñònh löôïng ñaøm. 92 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau CAÁY ÑÒNH LÖÔÏNG MAÃU ÑAØM – Caùc caâu hoûi thöôøng gaëp Trong tröôøng hôïp vieâm phoåi coäng ñoàng, coù caàn thieát phaûi caáy ñònh löôïng maãu ñaøm? ¦ Vieâm phoåi coäng ñoàng neáu laø nheï hay trung bình thì khoâng nhaát thieát phaûi caáy ñònh löôïng vì caùc vi khuaån gaây beänh thöôøng laø H. influenzae, M. catarrhalis vaø S. pneumoniae. Caùc vi khuaån naøy duø ñeàu coù theå laø vi khuaån thöôøng truù vuøng haàu hoïng nhöng khoù coù theå moïc ñöôïc treân moâi tröôøng nuoâi caáy neáu chuùng ôû daïng thöôøng truù vì soá löôïng raát ít. Chính vì vaäy chuùng ta chæ caàn ñaùnh giaù maãu ñaøm qua pheát nhuoäm Gram, neáu thaáy tin caäy thì tieán haønh nuoâi caáy bình thöôøng chöù khoâng caàn caáy ñònh löôïng. ¦ Ñoái vôùi vieâm phoåi coäng ñoàng naëng, caùc vieâm phoåi beänh vieän thì raát caàn thieát phaûi caáy ñònh löôïng maãu ñaøm vì taùc nhaân vi khuaån gaây beänh thöôøng laø caùc tröïc khuaån Gram [-] deã moïc hay laø tuï caàu maø ñaây laø caùc vi khuaån coù theå laø caùc vi khuaån taïm truù raát deã moïc treân caùc hoäp thaïch phaân laäp duø soá löôïng vi khuaån hieän dieän ít trong maãu. Khi tieán haønh caáy ñònh löôïng, coù caàn ñaùnh giaù maãu ñaøm tröôùc qua pheá nhuoäm Gram khoâng? ¦ Caáy ñònh löôïng nhaèm muïc ñích laø chæ baét caùc vi khuaån coù soá löôïng lôùn trong maãu ñaøm vì ñaây môùi chính laø taùc nhaân gaây beänh thaät söï. Do vaäy veà nguyeân taéc khoâng nhaát thieát phaûi ñaùnh giaù maãu ñaøm tröôùc khi caáy ñònh löôïng. ¦ Tuy nhieân vì qui trình caáy ñònh löôïng ngoaøi vieäc phaûi duøng boä thuoác thöû laøm tan ñaøm, chuùng ta coøn phaûi söû duïng soá löôïng hoäp thaïch phaân laäp nhieàu gaáp 3 laàn phöông phaùp caáy khoâng ñònh löôïng, do vaäy raát caàn thieát phaûi ñaùnh giaù maãu ñaøm ñeå chæ tieáp tuïc qui trình caáy ñònh löôïng khi maãu ñaøm ñöôïc ñaùnh giaù laø tin caäy hay tin caäy vöøa, nhôø vaäy chuùng ta coù theå tieát kieäm vì khoâng phaûi tieán haønh caáy ñònh löôïng maãu khoâng tin caäy. Coù khi naøo trong keát quaû caáy ñònh löôïng ñaøm cho keát quaû soá löôïng vi khuaån gaây beänh treân 1.000 hay 10.000, maø keát quaû ñaùnh giaù ñaøm qua pheát nhuoäm Gram quan saùt ôû quang tröôøng X100 laïi khoâng tin caäy khoâng? ¦ Treân thöïc teá coù phoøng thí nghieäm caáy ñònh löôïng ñaøm cho keát quaû nhö treân. Tuy nhieân vôùi nghieân cöùu maø chuùng toâi ñaõ tieán haønh taïi phoøng thí nghieäm cuûa mình thì 100% caùc maãu khoâng tin caäy ñeàu cho keát quaû ñònh löôïng vôùi soá löôïng vi khuaån (öùng vôùi moãi loaïi) <1.000CFU/ml. 93 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau ¦ Keát quaû naøy caøng khaúng ñònh laø khoâng neân caáy ñònh löôïng khi pheát nhuoäm Gram maãu ñaøm quan saùt döôùi kính hieån vi vôùi quang tröôøng X100 cho thaáy coù >10 teá baøo bieåu moâ vaø <25 teá baøo baïch caàu. ¦ Do vaäy, coù leõ phoøng thí nghieäm naøy ñaõ quan nieäm sai veà caùch tính soá löôïng vi khuaån, thay vì laø soá löôïng cuûa töøng loaïi vi khuaån, hoï laïi tính soá löôïng cuûa taát caû caùc loaïi vi khuaån hieän dieän trong maãu ñaøm. Caáy ñònh löôïng ñaøm coù khaû thi khoâng vôùi ñieàu kieän hieän nay taïi caùc phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng beänh vieän? ¦ Tröôùc ñaây, khoù coù theå caáy ñònh löôïng ñaøm vì ñoøi hoûi phaûi coù thuoác thöû laøm tan ñaøm phaûi ñaët mua nöôùc ngoaøi vaø giaù thaønh khaù ñaét. Hieän nay boä thuoác thöû laøm tan ñaøm ñeå caáy ñònh löôïng ñaøm ñaõ ñöôïc coâng ty Nam Khoa (ñaït ISO 9001:2000) nghieân cöùu thaønh coâng vaø saûn xuaát trong nöôùc vôùi saûn phaåm mang teân SPUTAPREP-QT. Saûn phaåm naøy raát tieát kieäm vaø tieän duïng nhôø ñöôïc chia nhoû ñeå coù theå thöïc hieän treân toái thieåu 2 maãu ñaøm trong ngaøy. ¦ Neáu ñöôïc trang bò SPUTAPREP-QT; vaø coù theâm caùc loaïi moâi tröôøng phaân laäp laø MC, BA maùu cöøu, CA giaøu XV (caùc moâi tröôøng naøy cuõng ñaõ ñöôïc coâng ty Nam Khoa saûn xuaát döôùi daïng cheá saün hay saün saøng ñeå cheá); caùc phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng beänh vieän hoaøn toaøn coù theå caáy ñònh löôïng ñöôïc maãu ñaøm maø khoâng gaëp baát cöù khoù khaên hay trôû ngaïi gì. Khi naøo thì neân chæ ñònh caáy ñònh löôïng ñaøm? ¦ Thaät ra caáy ñònh löôïng ñaøm coù theå chæ ñònh cho taát caû caùc tröôøng hôïp caáy ñaøm. Tuy nhieân nhö ñaõ noùi ôû treân, caáy ñònh löôïng ñaøm toán keùm gaáp 3 laàn hôn caáy khoâng ñònh löôïng. Do vaäy, chuùng ta khoâng caàn thieát cho caáy ñònh löôïng ñoái vôùi caùc tröôøng hôïp vieâm phoåi coäng ñoàng nheï vaø vöøa. ¦ Raát caàn thieát phaûi cho caáy ñònh löôïng ñaøm caùc tröôøng hôïp vieâm phoåi naëng, caùc tröôøng hôïp vieâm phoåi beänh vieän, caùc tröôøng hôïp vieâm phoåi naèm taïi caùc phoøng caáp cöùu vaø phoøng chaêm soùc taêng cöôøng (ICU). ¦ Cuõng neân cho caáy ñònh löôïng khi khi quan saùt ñaïi theå caùc maãu ñaøm laáy ñöôïc thaáy coù laãn nöôùc boït. ¦ Moät nguyeân taéc maø chuùng toâi cho laø raát caàn thieát phaûi tuaân theo ñeå tieát kieän chi phí cho beänh nhaân vaø beänh vieän, ñoù laø khoâng caáy ñònh löôïng khi quan saùt vi theå maãu ñaøm qua pheát nhuoäm Gram cho thaáy laø maãu hoaøn toaøn khoâng tin caäy. 94 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Saûn phaåm lieân quan: SPUTAPREP-QT – Boä thuoác thöû laøm tan ñaøm ñeå caáy ñònh löôïng ñaøm Nguyeân taéc hoaït ñoäng Boä thuoác thöû hoaït ñoäng döïa treân nguyeân taéc duøng N-Acetyl-L-Cysteine (NALC) ñeå laøm tan ñaøm vaø caùc nhaày nhôùt trong ñaøm, nhôø vaäy laøm ñoàng nhaát ñöôïc maãu ñeå coù theå tieán haønh caáy ñònh löôïng, taùch chieát ñöôïc nucleic acid cuûa virus hay vi khuaån gaây beänh coù trong ñaøm ñeå laøm thöû nghieäm PCR... Thaønh phaàn thuoác thöû SPUTAPREP-QT daønh cho 10 maãu ñaøm goàm caùc thaønh phaàn sau: 1. N-Acetyl-L-Cysteine (NALC): boät nguyeân chaát chöùa trong 5 tube Eppendorf nhoû, moãi tube chöùa NALC ñuû duøng cho xöû lyù 2 maãu ñaøm. 2. Dung dòch nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng: Chöùa trong tube 15ml naép vaën chaët, moãi tube chöùa 10ml nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng. Boä thuoác thöû SPUTAPREP-QT chöa duøng hay ngay sau khi duøng neân ñöôïc giöõ trong tuû laïnh 4oC cho ñeán ngaøy heát haïn ghi treân hoäp (2 naêm sau ngaøy saûn xuaát). Phöông phaùp laøm tan ñaøm vôùi SPUTEPREP-QT 1. Trong moät tube 15ml voâ truøng naép xanh (loaïi Falcon) ñaõ chöùa 10ml nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng (NS), cho theâm vaøo 50mg NALC (N-Acetyl-L-Cysteine), töùc laø toaøn boä boät NALC chöùa trong moät tube Eppendorf. Laéc nheï cho tan hoaøn toaøn. Dung dòch NS coù NALC naøy chæ duøng trong ngaøy vaø ñuû cho 2 – 3 maãu. Luoân luoân baûo quaûn tube dung dòch NALC ñaõ pha trong tuû laïnh 4oC. 2. Laáy moät theå tích ñaøm caàn nuoâi caáy cho vaøo moät tube voâ truøng naép vaën chaët (hay loï voâ truøng naép ñoû). Theâm vaøo moät theå tích nhö vaäy dung dòch NS coù NALC vöøa môùi pha. Laéc nheï cho ñeán khi ñaøm tan trong dung dòch naøy. Nhö vaäy chuùng ta ñaõ coù ñaøm ñaõ tan vaø ñöôïc pha loaõng 1/2. Ñaøm ñaõ tan naøy saõn saøng cho qui trình caáy ñònh löôïng hay qui trình taùch chieát nucleic acid cho PCR hay RT-PCR ñeå phaùt hieän caùc taùc nhaân vi khuaån hay virus gaây beänh coù trong maãu ñaøm. 95 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau A D B E C Hình 28: Một số hình ảnh cấy ñònh lượng mẫu ñaøm treân maët thaïch phaân laäp: (A) thaïch naâu vôùi khuùm vi khuaån nghi ngôø M. catarrhalis, (B) thaïch naâu vôùi nhieàu khuùm vi khuaån nghi ngôø S. pneumoniae coù taïp nhieãm nhieàu vi khuaån haàu hoïng khaùc, (C, D) thaïch maùu vôùi nhieàu khuùm vi khuaån nghi ngôø Streptococcus feacalis, (E) thaïch MC vôùi caùc khuùm vi khuaån nghi ngôø Acinetobacter. 96