Bộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
•
•
•
•
NGUYỄN KIM LIÊN
CẢI TIÉN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT
CURCUMINOID TỪ NGHỆ
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Văn Hân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
I R U O N íí
HÀ N Ộ I-2011
ị)
! Ì k) C í i À N Ộ I I
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận này, em đã nhận được
sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè. Em
xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết on sâu sắc tới :
TS.Nguyễn Văn Hân
Thầy đã luôn chỉ bảo hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các
thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Công nghiệp Dược, các
thầy cô trong Ban giám hiệu, Phòng đào tạo cùng toàn thể các thầy cô,
cán bộ trong trường đại học Dược Hà Nội.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ em trong suốt
quá trình học tập và thực hiện khóa luận này
Hà Nội, tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Nguyễn Kim Liên
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐÈ:.............................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................2
1.1. Nghệ vàng...................................................................................................2
1.1.1. Mô tả cây.................................................................................................2
1.1.2. Phân bố....................................................................................................2
1.1.3. Thành phần............................................................................................. 2
1.2. Curcuminoid.............................................................................................. 3
1.2.1. Độ tan...................................................................................................... 4
1.2.2. Tính chất hóa h ọ c ...................................................................................4
1.2.3. Độ ổn định.............................................................................................. 6
1.2.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................7
1.3.Một số nghiên cứu về chiết xuất curcuminoid từ củ nghệ vàng..............8
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u ....... 10
2.1. Nguyên liệu và thiết b ị.............................................................................. 10
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất.................................................................. 10
2.1.2. Máy móc, thiết b ị....................................................................................10
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................... 11
2.3. Phương pháp thực nghiệm........................................................................11
2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu................................................................ 11
2.3.2. Phương pháp định lư ợ ng.......................................................................... 11
2.3.3. Xác định một số thông số chiết xuất.........................................................13
2.3.4. Phương pháp tinh c h ế ...............................................................................14
CHƯƠNG 3 : T H ựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................. 15
3.1. Khảo sát phưong pháp xử lý dược liệu.....................................................15
3.2. Khảo sát dung môi chiết .......................................................................... 16
3.3. Xây dựng phương pháp tinh chế.............................................................. 20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: So sánh một số tính chất vật lý của các curcuminoid............................3
Bảng 2: Đặc điểm bột nghệ chế bằng 2 phương pháp.......................................15
Bảng 3: Hiệu suất curcuminoid chiết được theo thời gian của NL1,NL2
trong các dung môi ethanol 96%, aceton.......................................................... 17
Bảng 4 : So sánh một số thông số khi chiết NLl, NL2 với ethanol 96%,
aceton.................................................................................................................. 19
Bảng 5 : So sánh 2 phương pháp tinh chế để thu được curcuminoid th ô .........21
Bảng 6 : Sản phẩm curcuminoid kết tinh trong các dung môi khác nhau....... 24
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1 : Công thức cấu tạo của curcuminoid..............................................3
Hình 2: Curcumin trong dung dịch..............................................................4
Hình 3: Phản ứng amin hóa ß- diceton của curcumin................................. 5
Hình 4: Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch....................... 6
Hình 5: Sản phẩm phẩm hủy của curcumin.................................................7
Hình 6 : Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết theo thời gian của NLl trong các
dung m ô i...................................................................................................... 18
Hình 7: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết theo thời gian của NL2 trong các
dung m ô i...................................................................................................... 18
Hình 8 : sắc ký đồ của sản phẩm thô 1 và thô 2 ........................................ 22
Hình 9 : sắc ký đồ của curcuminoid chuẩn...............................................25
Hình 10 : sắc ký đồ các mẫu kết tinh trong ethyl acetat...........................25
ĐẶT VẤN ĐÈ
Nghệ từ lâu đã được dùng không chỉ như một gia vị, chất màu thực
phẩm mà còn được sử dụng trong chữa bệnh và làm đẹp.Các nghiên cứu
khoa học đã tìm ra hoạt chất quan trọng có tác dụng trong củ nghệ đó là
curcuminoid. Curcuminoid được chỉ ra rằng có khả năng chống viêm,
kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa,.. .có vai trò to lớn trong việc
phòng và điều trị nhiều bệnh đưÒTig tiêu hóa, tim mạch, thần kinh...
Trong đó, tác dụng đang được quan tâm là khả năng chống tế bào ung
thư. Curcuminoid diệt các tế bào ác tính, vô hiệu hóa tế bào ung thư và
ngăn chặn hình thành tế bào ung thư mới mà không làm ảnh hưởng đến
các tế bào lành tính. Từ đó mở ra triển vọng trong chữa trị ung thư.
Nước ta có nguồn nguyên liệu nghệ phong phú là tiềm năng cho việc
chiết xuất curcuminoid. Đã có nhiều nghiên cứu về chiết xuất
curcuminoid cả trong và ngoài nước. Song việc nghiên cứu để tìm ra
những điều kiện chiết xuất tốt hơn, đơn giản hofĩi vẫn luôn là cần thiết.
Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi thực hiện đề tài “Cải tiến
phương pháp chiết xuất curcuminoid từ nghệ” vớinhững nội dung
nghiên cứu:
- Khảo sát phương pháp xử lý dược liệu.
- Khảo sát lựa chọn dung môi chiết.
- Xây dựng phương pháp hiệu quả để tinh chế.
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Nghệ vàng
Tên khoa học: Curcuma ỉonga
Họ Gừng Zingiberaceae.
1.1.1. Mô tả cây
Cây thảo, cao 0,6 - Im. Thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi cắt
ngang có màu vàng sẫm. Lá hình trái xoan thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều
nhẵn dài tới 45 cm, rộng tới 18 cm.Cuống lá có bẹ. Cụm hoa mọc từ giữa
các lá lên thành hình nón thưa, lá bắc hữu thụ khum hình máng rộng, đầu
tròn màu xanh lục nhạt, lá bắc bất thụ hẹp hơn, màu hơi tím nhạt. Tràng có
phiến, cánh hoa ngoài màu xanh lục vàng nhạt, chia thành ba thùy, thùy
trên to hơn, phiến cánh hoa trong cũng chia ba thùy, hai thùy hai bên đứng
và phẳng, thùy dưới hõm thành máng sâu. Quả nang ba ngăn, mở bằng ba
van. Hạt có áo hạt. [3].
1.1.2. Phăn bố
Mọc và trồng ở Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Indonesia và các
nước nhiệt đới.
ở nước ta nghệ vàng trồng khá phổ biến. Một số địa phương hình thành
các vùng chuyên canh như Xuân Lộc (Đồng Nai), Chí Tân ( Khoái Châu,
Hưng Yên), Nghệ An.
1.1.3. Thành phần
Tinh dầu
Chiếm 3-5% [3], thành phần gần 100 hợp chất hóa học hầu hết là các
sesquiterpen. Trong số đó, a-turmeron và turmeron chiếm gần 50%. Ngoài
ra còn 1 lượng nhỏ alcol mạch ngắn, các ceton, acid béo. [ \ T .
Nhóm chất màu Curcumỉnoỉd: thành phần có tác dụng quan trọng nhất
của củ nghệ vàng chủ yếu gồm 3 chất: Curcumin (Curcumin I),
Demethoxycurcumin ( Curcumin II), Bisdemethoxycurcumin (Curcumin
III). Trong đó curcumin chiếm chủ yếu.
Các hơp chất khác: protein, chất béo, chất khoáng, nước, tinh bột,
nhựa....
1.2. Curcuminoid
Hình 1 : Công thức cấu tạo của curcuminoid
Bảng 1: Tính chất vật lý của các curcuminoid
Curcum in I
Curcum in I I
Curcumin I I I
Ri
0CH3
0CH3
H
R2
0CH3
H
H
Tên khoa
học
CTPT
PTL
Dạng thù
hình[5]
Điêm
l, 7-Bis-(4-
l-( 4-
l,7-Bis-(4-
hydroxy-3-
hydroxypheny1)-7-
hydroxyphenyl)-
methoxyphen
(4-hydroxy-3-
hepta-l,6-dien-3,5-
yl)-hepta-l,6-
methoxyphenyl)hept
dion
dien-3,5-dion
a-1,6-dien-3,5-dion
C21H20O 6
C20H18O5
C19H16O4
368
338
308
Tinh thê
Tinh thê hình
Tinh thê hình
hình kim,
kim,màu vàng
kim, màu vàng
màu vàng
cam
cam tím.
184
172
222
chảy (°
C)[12],
[15]
Điểm chảy của curcuminoid: 172-178
1.2.1. Đô tan
Không tan trong nước ở pH acid và trung tính, ether xăng,...
Tan trong cồn etylic, acid acetic băng, propylen glycol, kiềm, aceton và
ethyl ether...[10], [17].
Curcumin và các dẫn chất tồn tại trong dung dịch trong hỗn họp cân bằng
của dạng diceton cân đối và dạnghỗ biến keto-enol được ổn định bằng liên
kết H nội phân tử [17’.
Hình 2; Curcumin trong dung dịch
1.2.2. Tính chất hóa học
Tỉnh chất của nhóm polyphenol
- Tan trong kiềm.
- Tác dụng với tác nhân oxy hóa: nhóm -O H hoạt hóa nhân thơm đối
với các tác nhân oxy hóa nên curcuminoid rất dễ bị oxy hóa.
- Thế ái điện tử: hưÓTig nhóm thế vào vị trí ortho, para.
- Thế ái nhân.
- Tác dụng với dung dịch muối kim loại tạo phức chất có màu: với
tạo muối màu xanh đen, với Sn, Zn, Cu, Ca, Mg tạo hợp chất màu
vàng cam đến nâu đen.
Tính chất của nhóm diceton
trong môi trưÒTig acid acetic, tác nhân amin hóa hydroxamin ( Y =
OH-), phenylhydrazin ( Y= CóHs- NH-) curcumin cũng như curcuminoid
phản ứng tạo sản phẩm có tính kháng nấm và chống oxi hóa tốt. [2 ].
•CH=CH-C-CH2-CCH=C
ỉi
o
0CH3
CH3^
Y-NH,
.CH=CH-C=CH-C-CH=CH
HO
Y----- N
/
CH3O
OOH3
Hình 3: Phản ứng amin hóa p- diceton của curcumin
Anh hưởỉĩ£ của p H trons duns dich nước [101
- pH < 1: dung dịch nước của curcumin có màu đỏ và tồn tại ở dạng
ion EUA"^.
- pH 1-7: curcumin rất ít tan trong nước, tạo dung dịch màu vàng và
tồn tại ở dạng H 3A.
- pH > 7.5; dung dịch có màu đỏ, tồn tại ở các dạng là HiA', HA^' và
A^' lần lượt tương ứng với các giá trị pH 7.8, 8.5 và 9.0
H.AOH
HiA
OH
HCiO'
7.
Curcumin phân hủy ở pH từ 7- 10 tạo ra sản phẩm ban đầu là acid femlic
và feruloylmethan nhanh chóng bị chuyển màu ( chủ yếu là từ vàng đến
vàng nâu), ngoài ra còn có các sản phẩm ngưng tụ. Sau đó, feruloylmethan
bị phân hủy thành vanillin và acetone. [ 10],
7
i)
cyo
o
o
. A
HO
OCHi
Vá.níl]i:n
ĩi::rtí3iiiĩ
Hình 5; Sản phẩm phẩm hủy của curcumin
Đặc biệt, curcumin không bền dưới tác dụng của ánh sáng nhất là trong
dung dịch. Sau khi chiếu bức xạ quang, xác định thấy rằng, chúng giống
các sản phẩm phân hủy như acid ferulic, acid vanillic, vanillin. [ 10].
1.2.4. Tác dụng dược lỷ
Curcuminoid có rất nhiều tác dụng đã được chứng minh có lợi cho việc
phòng và điều trị bệnh.
Một số tác dụng nổi bật là:
* Chổng oxy hỏa
Tác dụng chống oxi hóa của curcuminoid gấp ít nhất 10 lần các chất
oxi hóa khác thậm chí cả vitamin E. [1
* Chống HIV
Sui và cộng sự (1993) đã báo cáo khả năng ức chế HIV-1 và HIV-2
protease bởi curcuminoid và phức hợp curcuminoid- boron. [14 .
8
* Chống ung thư
Curcuminoid ngăn chặn biến đổi, khởi phát u, phát triển u, xâm lấn, hình
thành mạch và di căn. Nghiên cứu in vivo cho thấy curcumin ức chế chất
gây ung thư da, một già, ruột kết, gan ở chuột, động vật có vú, ức chế sinh
sôi tế bào u gồm tế bào bạch cầu B,T, ung thư biểu mô ruột kết, biểu bì, vú.
[6].
* Chống viêm
Curcuminoid có hoạt tính chống viêm cao. Curcuminoid làm bất hoạt các
enzym tham gia vào phản ứng viêm thông qua cơ chế chủ yếu là ức chế
receptor NF-kB. [15\
1.3.Một số nghiên cứu về chiết xuất curcuminoìd từ củ nghệ vàng
Janaki và Bose (1967) tiến hành chiết bột dược liệu với hexan để loại
tinh dầu và chất béo, sau đó chiết với benzen. Làm lạnh và kết tinh bằng
ethanol thu được tinh thể hình kim màu vàng cam, hiệu suất 1,1% • [9 .
Stransky (1979) chiết bằng dung dịch xà phòng ở pH 7 hoặc cao hơn
một chút ở 60- 90° c. Phương pháp có nhược điểm là curcuminoid thu
được ở dạng bột nhão và khi chiết với dung dịch có pH kiềm ở nhiệt độ
cao có thể làm thay đổi cấu trúc curcuminoid [13].
Baumann, Rodrigues, and Viana (2000) chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn
bổ sung 10% ethanol. Mặc dù việc chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn là kỹ
thuật sạch thu được lượng curcuminoid mong muốn và tinh khiết, nhưng
bất lợi chủ yếu là việc chiết phải tiến hành ở áp suất cao. Điều này sẽ khó
khăn hoTi khi chiết ở quy mô lớn. [7].
Đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi chiết curcumin bằng hỗn hợp dung môi
aceton- ethyl acetat ( 6,5:1) trong bình cầu có sinh hàn hồi lưu,nhiệt độ
chiết 6 . Dịch chiết làm bay hết dung môi, tách tinh dầu bằng ether
ethylic, sản phẩm curcuminoid thô được kết tinh lại trong cồn tuyệt đối.
Hiệu suất là 3,9 % .[2].
Đào Hùng Cường, Nguyễn Đình Anh chiết curcumin thô bằng dung
dịch xà phòng 42,5% được tạo từ dầu lạc, nhiệt độ chiết 90° c. Hiệu suất
chiết curcumin thô là 44,58% . [ r .
Dandekar và Gaikar (2002) nghiên cứu kỹ thuật chiết sử dụng vi sóng.
Kỹ thuật này có ưu điểm là chiết curcuminoid có tính chọn lọc và nhanh.
Bột nghệ được chiếu vi sóng 2-4 phút cho hiệu quả chiết ngang với việc
chiết bằng aceton trong 60 phút. [8 ]
Nguyễn Đình Tỵ và cộng sự, chiết tách curcumin từ củ Nghệ Vàng với
quy trình như sau: dược liệu thái lát 2 - 3mm, sấy ở 60^*^, nghiền mịn
thành bột có cỡ hạt khoảng SOOịxm. Bột nghệ được chiết nóng với ether
dầu hỏa để loại tinh dầu và nhựa, sau đó chiết bằng hỗn hợp dung môi
aceton/ ethylacetat (1: 9) ở 65*’c. Thu dịch chiết,cất loại dung môi ở
nhiệt độ thường thu được curcuminoid thô. Rửa curcuminoid thô bằng
hỗn họp aceton/ether dầu hỏa (9:1). Cuối cùng kết tinh lại curcuminoid
thô trong cồn.Từ 4 kg nghệ bột thu được 61,5 g hoạt chất có hàm lượng
92,5%.[4].
10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOÍNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.L1. Nguyên vật liệu và hóa chất:
- Nguyên liệu :
Củ nghệ vàng trồng ở xã Chí Tân, Khoái Châu, Hưng Yên thu hoạch
cuối tháng 12.
- Hóa c h ất:
+ Curcuminoid chuẩn (hàm lượng 98,1%).
+ Ethanol 96%.
+ Methanol.
+ Aceton.
+ Dicloromethan.
+ Ethyl acetat.
+ Xăng công nghiệp.
+ n- hexan.
+ Tetrahydrofuran.
+ Acid citric.
+ Nước cất hai lần.
2.1.2. Máy móc, thiết b ị :
- Máy HPLC Shimadzu SPD-MIO Avp.
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H .
- Máy cất quay Buchi B480.
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S với độ chính xác ±lmg.
- Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S.
- Màng lọc 0,45 |im.
- Dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, bình cầu, bình gạn, pipet, ống
đong, pipet, cốc có mỏ, ống nghiệm...
11
f T ( <7
A ___
- Tủ sây.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát phương pháp xử lý dược liệu: loại tinh bột và không loại
tinh bột.
2.2.2.Khảo sát lựa chọn dung môi chiết: ethanol 96% , aceton .
2.2.3.Xây dựng phương pháp hiệu quả để tinh chế curcuminoid.
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu
Phương pháp 1
Nghệ tươi rửa sạch, thái lát mỏng, sấy trong tủ sấy ở 60°c đến khô.
Xay thành bột thô (NLl).
Phương pháp 2
Nghệ tươi rửa sạch, xay nghiền bằng máy xay,ngâm trong nước,
thỉnh thoảng khuấy để tinh bột tách ra. Lọc qua túi lọc thu được bã
đem sấy ở 60° c đến khô (NL2). Phần nước để lắng gạn thu được tinh
bột.
2.3.2. Phương pháp định lượng
Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo dược điển Mỹ
USP- 32 .
Chuân bị mâu:
Mầu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 20 mg curcuminoid chuẩn vào bình định mức
50ml, pha loãng bằng pha động. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào
bình định mức 50 ml, thêm pha động đến vạch. Lọc qua màng 0,45 |im.
12
Mầu thử:
- Dược liệu: cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu cho vào bình nón.
Thêm 20 ml aceton, đậy kín, siêu âm 30 phút. Lọc lấy dịch. Bã được
siêu âm tiếp với 20 ml aceton trong khoảng 15 phút. Lọc lấy dịch. Gộp
các dịch lọc, pha loãng bằng pha động với tỷ lệ thích hợp để thu được
dung dịch có nồng độ tương đương nồng độ mẫu chuẩn. Lọc qua màng
0,45 |im.
- Dịch chiết: hút chính xác 1 ml dịch chiết, pha loãng bằng pha động
với tỷ lệ thích hợp để thu được dung dịch có nồng độ tương đương
nồng độ mẫu chuẩn. Lọc qua màng 0,45 ịim.
- Sản phẩm ( curcuminoid thô, curcuminoid kết tinh lại): cân chính xác
khoảng 20 mg sản phẩm vào bình định mức 50ml, pha loãng bằng pha
động. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml,
thêm pha động đến vạch. Lọc qua màng 0,45 Ịxm.
Điều kiện sắc kỷ:
Cột Phenomenex Ci8 (4,6 mm
25 cm)
Pha động: dung dịch acid citric 0,1% : tetrahydroíìiran (6:4)
Tốc độ dòng Iml/phút
Detector 420 nm
Thể tích tiêm mẫu: 20 |il
Tính hàm lượng curcuminoid trong mẫu thử
F ị=
x mr
" x 100
Sf X ìĩir, X Fr x / j
13
Trong đó:
Ft , Fc là hàm lượng phần trăm curcuminoid trong mẫu thử, mẫu
chuẩn(%)
St, Sc là diện tích pic của curcuminoid trong mẫu thử, mẫu chuẩn
nit ,nic là khối lượng mẫu thử, mẫu chuẩn (g)
f t, fc là hệ số pha loãng của mẫu thử, mẫu chuẩn
2.3.3. Xác định một số thông sổ chiết xuất
Xác đinh khả nâng hòa tan curcuminoid của dung mỏi chiết
Cân khoảng 0,50 g curcuminoid chuẩn cho vào bình nón. Thêm 5 ml
dung môi. Siêu âm khoảng 30 phút. Lọc lấy dịch. Hút chính xác Iml
dịch, pha loãng f (lần) thích hợp. Lọc qua màng 0,45 Ịim rồi định lượng
bằng HPLC
Độ tan của curcuminoỉd trong 1 ml dung môi:
Sf X
c, X /
^
_
/m.g \
■' X l o o o ( ^ )
^ ml >
Xác đinh thời điểm cân bằng chiết
Chiết a (g) dược liệu hàm lượng curcuminoid Ft (%) với V ( ml) dung
môi trong điều kiện xác định
Sau mỗi khoảng thời gian lấy chính xác một thể tích dịch chiết đem pha
loãng ft lần và định lượng hàm lượng curcuminoid chiết được theo thời
gian bằng HPLC. Từ đó tính được hiệu suất chiết curcuminoid theo thời
gian
Hiệu suất chiết curcumỉnoỉd theo thời gian:
SịXC.xũxV
5^ X a X
_
14
Thời điểm cân bằng là thời điểm hiệu suất chiết curcuminoid không tăng
thêm (Lcb)
Xác đinh khối lương cắn
Dịch chiết thu được đem cô đến cắn. cắn để trong bình hút hẩm khoảng
24 giờ sau đó đem cân xác định khối lượng mcắn
Xác đinh hàm lương curcuminoid trong cắn
L^Ị, Xa X Ff
- (% )
2.3.4. Phương pháp tinh chế
- Sử dụng các dung môi thích họp để loại bớt tạp chất và kết tinh sản
phẩm
- Loại tạp chất màu bằng than hoạt
- Xem thêm -