Cải tiến phương pháp chiết xuất Curcuminoid từ nghệ.

  • Số trang: 36 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 65 |
  • Lượt tải: 1
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • NGUYỄN KIM LIÊN CẢI TIÉN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT CURCUMINOID TỪ NGHỆ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược I R U O N íí HÀ N Ộ I-2011 ị) ! Ì k) C í i À N Ộ I I LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận này, em đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè. Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết on sâu sắc tới : TS.Nguyễn Văn Hân Thầy đã luôn chỉ bảo hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận. Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Công nghiệp Dược, các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phòng đào tạo cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ trong trường đại học Dược Hà Nội. Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này Hà Nội, tháng 05 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Kim Liên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐÈ:.............................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................2 1.1. Nghệ vàng...................................................................................................2 1.1.1. Mô tả cây.................................................................................................2 1.1.2. Phân bố....................................................................................................2 1.1.3. Thành phần............................................................................................. 2 1.2. Curcuminoid.............................................................................................. 3 1.2.1. Độ tan...................................................................................................... 4 1.2.2. Tính chất hóa h ọ c ...................................................................................4 1.2.3. Độ ổn định.............................................................................................. 6 1.2.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................7 1.3.Một số nghiên cứu về chiết xuất curcuminoid từ củ nghệ vàng..............8 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u ....... 10 2.1. Nguyên liệu và thiết b ị.............................................................................. 10 2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất.................................................................. 10 2.1.2. Máy móc, thiết b ị....................................................................................10 2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................... 11 2.3. Phương pháp thực nghiệm........................................................................11 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu................................................................ 11 2.3.2. Phương pháp định lư ợ ng.......................................................................... 11 2.3.3. Xác định một số thông số chiết xuất.........................................................13 2.3.4. Phương pháp tinh c h ế ...............................................................................14 CHƯƠNG 3 : T H ựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................. 15 3.1. Khảo sát phưong pháp xử lý dược liệu.....................................................15 3.2. Khảo sát dung môi chiết .......................................................................... 16 3.3. Xây dựng phương pháp tinh chế.............................................................. 20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: So sánh một số tính chất vật lý của các curcuminoid............................3 Bảng 2: Đặc điểm bột nghệ chế bằng 2 phương pháp.......................................15 Bảng 3: Hiệu suất curcuminoid chiết được theo thời gian của NL1,NL2 trong các dung môi ethanol 96%, aceton.......................................................... 17 Bảng 4 : So sánh một số thông số khi chiết NLl, NL2 với ethanol 96%, aceton.................................................................................................................. 19 Bảng 5 : So sánh 2 phương pháp tinh chế để thu được curcuminoid th ô .........21 Bảng 6 : Sản phẩm curcuminoid kết tinh trong các dung môi khác nhau....... 24 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 : Công thức cấu tạo của curcuminoid..............................................3 Hình 2: Curcumin trong dung dịch..............................................................4 Hình 3: Phản ứng amin hóa ß- diceton của curcumin................................. 5 Hình 4: Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch....................... 6 Hình 5: Sản phẩm phẩm hủy của curcumin.................................................7 Hình 6 : Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết theo thời gian của NLl trong các dung m ô i...................................................................................................... 18 Hình 7: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết theo thời gian của NL2 trong các dung m ô i...................................................................................................... 18 Hình 8 : sắc ký đồ của sản phẩm thô 1 và thô 2 ........................................ 22 Hình 9 : sắc ký đồ của curcuminoid chuẩn...............................................25 Hình 10 : sắc ký đồ các mẫu kết tinh trong ethyl acetat...........................25 ĐẶT VẤN ĐÈ Nghệ từ lâu đã được dùng không chỉ như một gia vị, chất màu thực phẩm mà còn được sử dụng trong chữa bệnh và làm đẹp.Các nghiên cứu khoa học đã tìm ra hoạt chất quan trọng có tác dụng trong củ nghệ đó là curcuminoid. Curcuminoid được chỉ ra rằng có khả năng chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa,.. .có vai trò to lớn trong việc phòng và điều trị nhiều bệnh đưÒTig tiêu hóa, tim mạch, thần kinh... Trong đó, tác dụng đang được quan tâm là khả năng chống tế bào ung thư. Curcuminoid diệt các tế bào ác tính, vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành tế bào ung thư mới mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào lành tính. Từ đó mở ra triển vọng trong chữa trị ung thư. Nước ta có nguồn nguyên liệu nghệ phong phú là tiềm năng cho việc chiết xuất curcuminoid. Đã có nhiều nghiên cứu về chiết xuất curcuminoid cả trong và ngoài nước. Song việc nghiên cứu để tìm ra những điều kiện chiết xuất tốt hơn, đơn giản hofĩi vẫn luôn là cần thiết. Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi thực hiện đề tài “Cải tiến phương pháp chiết xuất curcuminoid từ nghệ” vớinhững nội dung nghiên cứu: - Khảo sát phương pháp xử lý dược liệu. - Khảo sát lựa chọn dung môi chiết. - Xây dựng phương pháp hiệu quả để tinh chế. Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Nghệ vàng Tên khoa học: Curcuma ỉonga Họ Gừng Zingiberaceae. 1.1.1. Mô tả cây Cây thảo, cao 0,6 - Im. Thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi cắt ngang có màu vàng sẫm. Lá hình trái xoan thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều nhẵn dài tới 45 cm, rộng tới 18 cm.Cuống lá có bẹ. Cụm hoa mọc từ giữa các lá lên thành hình nón thưa, lá bắc hữu thụ khum hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt, lá bắc bất thụ hẹp hơn, màu hơi tím nhạt. Tràng có phiến, cánh hoa ngoài màu xanh lục vàng nhạt, chia thành ba thùy, thùy trên to hơn, phiến cánh hoa trong cũng chia ba thùy, hai thùy hai bên đứng và phẳng, thùy dưới hõm thành máng sâu. Quả nang ba ngăn, mở bằng ba van. Hạt có áo hạt. [3]. 1.1.2. Phăn bố Mọc và trồng ở Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Indonesia và các nước nhiệt đới. ở nước ta nghệ vàng trồng khá phổ biến. Một số địa phương hình thành các vùng chuyên canh như Xuân Lộc (Đồng Nai), Chí Tân ( Khoái Châu, Hưng Yên), Nghệ An. 1.1.3. Thành phần Tinh dầu Chiếm 3-5% [3], thành phần gần 100 hợp chất hóa học hầu hết là các sesquiterpen. Trong số đó, a-turmeron và turmeron chiếm gần 50%. Ngoài ra còn 1 lượng nhỏ alcol mạch ngắn, các ceton, acid béo. [ \ T . Nhóm chất màu Curcumỉnoỉd: thành phần có tác dụng quan trọng nhất của củ nghệ vàng chủ yếu gồm 3 chất: Curcumin (Curcumin I), Demethoxycurcumin ( Curcumin II), Bisdemethoxycurcumin (Curcumin III). Trong đó curcumin chiếm chủ yếu. Các hơp chất khác: protein, chất béo, chất khoáng, nước, tinh bột, nhựa.... 1.2. Curcuminoid Hình 1 : Công thức cấu tạo của curcuminoid Bảng 1: Tính chất vật lý của các curcuminoid Curcum in I Curcum in I I Curcumin I I I Ri 0CH3 0CH3 H R2 0CH3 H H Tên khoa học CTPT PTL Dạng thù hình[5] Điêm l, 7-Bis-(4- l-( 4- l,7-Bis-(4- hydroxy-3- hydroxypheny1)-7- hydroxyphenyl)- methoxyphen (4-hydroxy-3- hepta-l,6-dien-3,5- yl)-hepta-l,6- methoxyphenyl)hept dion dien-3,5-dion a-1,6-dien-3,5-dion C21H20O 6 C20H18O5 C19H16O4 368 338 308 Tinh thê Tinh thê hình Tinh thê hình hình kim, kim,màu vàng kim, màu vàng màu vàng cam cam tím. 184 172 222 chảy (° C)[12], [15] Điểm chảy của curcuminoid: 172-178 1.2.1. Đô tan Không tan trong nước ở pH acid và trung tính, ether xăng,... Tan trong cồn etylic, acid acetic băng, propylen glycol, kiềm, aceton và ethyl ether...[10], [17]. Curcumin và các dẫn chất tồn tại trong dung dịch trong hỗn họp cân bằng của dạng diceton cân đối và dạnghỗ biến keto-enol được ổn định bằng liên kết H nội phân tử [17’. Hình 2; Curcumin trong dung dịch 1.2.2. Tính chất hóa học Tỉnh chất của nhóm polyphenol - Tan trong kiềm. - Tác dụng với tác nhân oxy hóa: nhóm -O H hoạt hóa nhân thơm đối với các tác nhân oxy hóa nên curcuminoid rất dễ bị oxy hóa. - Thế ái điện tử: hưÓTig nhóm thế vào vị trí ortho, para. - Thế ái nhân. - Tác dụng với dung dịch muối kim loại tạo phức chất có màu: với tạo muối màu xanh đen, với Sn, Zn, Cu, Ca, Mg tạo hợp chất màu vàng cam đến nâu đen. Tính chất của nhóm diceton trong môi trưÒTig acid acetic, tác nhân amin hóa hydroxamin ( Y = OH-), phenylhydrazin ( Y= CóHs- NH-) curcumin cũng như curcuminoid phản ứng tạo sản phẩm có tính kháng nấm và chống oxi hóa tốt. [2 ]. •CH=CH-C-CH2-CCH=C ỉi o 0CH3 CH3^ Y-NH, .CH=CH-C=CH-C-CH=CH HO Y----- N / CH3O OOH3 Hình 3: Phản ứng amin hóa p- diceton của curcumin Anh hưởỉĩ£ của p H trons duns dich nước [101 - pH < 1: dung dịch nước của curcumin có màu đỏ và tồn tại ở dạng ion EUA"^. - pH 1-7: curcumin rất ít tan trong nước, tạo dung dịch màu vàng và tồn tại ở dạng H 3A. - pH > 7.5; dung dịch có màu đỏ, tồn tại ở các dạng là HiA', HA^' và A^' lần lượt tương ứng với các giá trị pH 7.8, 8.5 và 9.0 H.AOH HiA OH HCiO' 7. Curcumin phân hủy ở pH từ 7- 10 tạo ra sản phẩm ban đầu là acid femlic và feruloylmethan nhanh chóng bị chuyển màu ( chủ yếu là từ vàng đến vàng nâu), ngoài ra còn có các sản phẩm ngưng tụ. Sau đó, feruloylmethan bị phân hủy thành vanillin và acetone. [ 10], 7 i) cyo o o . A HO OCHi Vá.níl]i:n ĩi::rtí3iiiĩ Hình 5; Sản phẩm phẩm hủy của curcumin Đặc biệt, curcumin không bền dưới tác dụng của ánh sáng nhất là trong dung dịch. Sau khi chiếu bức xạ quang, xác định thấy rằng, chúng giống các sản phẩm phân hủy như acid ferulic, acid vanillic, vanillin. [ 10]. 1.2.4. Tác dụng dược lỷ Curcuminoid có rất nhiều tác dụng đã được chứng minh có lợi cho việc phòng và điều trị bệnh. Một số tác dụng nổi bật là: * Chổng oxy hỏa Tác dụng chống oxi hóa của curcuminoid gấp ít nhất 10 lần các chất oxi hóa khác thậm chí cả vitamin E. [1 * Chống HIV Sui và cộng sự (1993) đã báo cáo khả năng ức chế HIV-1 và HIV-2 protease bởi curcuminoid và phức hợp curcuminoid- boron. [14 . 8 * Chống ung thư Curcuminoid ngăn chặn biến đổi, khởi phát u, phát triển u, xâm lấn, hình thành mạch và di căn. Nghiên cứu in vivo cho thấy curcumin ức chế chất gây ung thư da, một già, ruột kết, gan ở chuột, động vật có vú, ức chế sinh sôi tế bào u gồm tế bào bạch cầu B,T, ung thư biểu mô ruột kết, biểu bì, vú. [6]. * Chống viêm Curcuminoid có hoạt tính chống viêm cao. Curcuminoid làm bất hoạt các enzym tham gia vào phản ứng viêm thông qua cơ chế chủ yếu là ức chế receptor NF-kB. [15\ 1.3.Một số nghiên cứu về chiết xuất curcuminoìd từ củ nghệ vàng Janaki và Bose (1967) tiến hành chiết bột dược liệu với hexan để loại tinh dầu và chất béo, sau đó chiết với benzen. Làm lạnh và kết tinh bằng ethanol thu được tinh thể hình kim màu vàng cam, hiệu suất 1,1% • [9 . Stransky (1979) chiết bằng dung dịch xà phòng ở pH 7 hoặc cao hơn một chút ở 60- 90° c. Phương pháp có nhược điểm là curcuminoid thu được ở dạng bột nhão và khi chiết với dung dịch có pH kiềm ở nhiệt độ cao có thể làm thay đổi cấu trúc curcuminoid [13]. Baumann, Rodrigues, and Viana (2000) chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn bổ sung 10% ethanol. Mặc dù việc chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn là kỹ thuật sạch thu được lượng curcuminoid mong muốn và tinh khiết, nhưng bất lợi chủ yếu là việc chiết phải tiến hành ở áp suất cao. Điều này sẽ khó khăn hoTi khi chiết ở quy mô lớn. [7]. Đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi chiết curcumin bằng hỗn hợp dung môi aceton- ethyl acetat ( 6,5:1) trong bình cầu có sinh hàn hồi lưu,nhiệt độ chiết 6 . Dịch chiết làm bay hết dung môi, tách tinh dầu bằng ether ethylic, sản phẩm curcuminoid thô được kết tinh lại trong cồn tuyệt đối. Hiệu suất là 3,9 % .[2]. Đào Hùng Cường, Nguyễn Đình Anh chiết curcumin thô bằng dung dịch xà phòng 42,5% được tạo từ dầu lạc, nhiệt độ chiết 90° c. Hiệu suất chiết curcumin thô là 44,58% . [ r . Dandekar và Gaikar (2002) nghiên cứu kỹ thuật chiết sử dụng vi sóng. Kỹ thuật này có ưu điểm là chiết curcuminoid có tính chọn lọc và nhanh. Bột nghệ được chiếu vi sóng 2-4 phút cho hiệu quả chiết ngang với việc chiết bằng aceton trong 60 phút. [8 ] Nguyễn Đình Tỵ và cộng sự, chiết tách curcumin từ củ Nghệ Vàng với quy trình như sau: dược liệu thái lát 2 - 3mm, sấy ở 60^*^, nghiền mịn thành bột có cỡ hạt khoảng SOOịxm. Bột nghệ được chiết nóng với ether dầu hỏa để loại tinh dầu và nhựa, sau đó chiết bằng hỗn hợp dung môi aceton/ ethylacetat (1: 9) ở 65*’c. Thu dịch chiết,cất loại dung môi ở nhiệt độ thường thu được curcuminoid thô. Rửa curcuminoid thô bằng hỗn họp aceton/ether dầu hỏa (9:1). Cuối cùng kết tinh lại curcuminoid thô trong cồn.Từ 4 kg nghệ bột thu được 61,5 g hoạt chất có hàm lượng 92,5%.[4]. 10 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOÍNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 2.L1. Nguyên vật liệu và hóa chất: - Nguyên liệu : Củ nghệ vàng trồng ở xã Chí Tân, Khoái Châu, Hưng Yên thu hoạch cuối tháng 12. - Hóa c h ất: + Curcuminoid chuẩn (hàm lượng 98,1%). + Ethanol 96%. + Methanol. + Aceton. + Dicloromethan. + Ethyl acetat. + Xăng công nghiệp. + n- hexan. + Tetrahydrofuran. + Acid citric. + Nước cất hai lần. 2.1.2. Máy móc, thiết b ị : - Máy HPLC Shimadzu SPD-MIO Avp. - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H . - Máy cất quay Buchi B480. - Cân phân tích Mettler Toledo AB204S với độ chính xác ±lmg. - Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S. - Màng lọc 0,45 |im. - Dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, bình cầu, bình gạn, pipet, ống đong, pipet, cốc có mỏ, ống nghiệm... 11 f T ( <7 A ___ - Tủ sây. - Máy đo nhiệt độ nóng chảy. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát phương pháp xử lý dược liệu: loại tinh bột và không loại tinh bột. 2.2.2.Khảo sát lựa chọn dung môi chiết: ethanol 96% , aceton . 2.2.3.Xây dựng phương pháp hiệu quả để tinh chế curcuminoid. 2.3. Phương pháp thực nghiệm 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu Phương pháp 1 Nghệ tươi rửa sạch, thái lát mỏng, sấy trong tủ sấy ở 60°c đến khô. Xay thành bột thô (NLl). Phương pháp 2 Nghệ tươi rửa sạch, xay nghiền bằng máy xay,ngâm trong nước, thỉnh thoảng khuấy để tinh bột tách ra. Lọc qua túi lọc thu được bã đem sấy ở 60° c đến khô (NL2). Phần nước để lắng gạn thu được tinh bột. 2.3.2. Phương pháp định lượng Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo dược điển Mỹ USP- 32 . Chuân bị mâu: Mầu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg curcuminoid chuẩn vào bình định mức 50ml, pha loãng bằng pha động. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml, thêm pha động đến vạch. Lọc qua màng 0,45 |im. 12 Mầu thử: - Dược liệu: cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu cho vào bình nón. Thêm 20 ml aceton, đậy kín, siêu âm 30 phút. Lọc lấy dịch. Bã được siêu âm tiếp với 20 ml aceton trong khoảng 15 phút. Lọc lấy dịch. Gộp các dịch lọc, pha loãng bằng pha động với tỷ lệ thích hợp để thu được dung dịch có nồng độ tương đương nồng độ mẫu chuẩn. Lọc qua màng 0,45 |im. - Dịch chiết: hút chính xác 1 ml dịch chiết, pha loãng bằng pha động với tỷ lệ thích hợp để thu được dung dịch có nồng độ tương đương nồng độ mẫu chuẩn. Lọc qua màng 0,45 ịim. - Sản phẩm ( curcuminoid thô, curcuminoid kết tinh lại): cân chính xác khoảng 20 mg sản phẩm vào bình định mức 50ml, pha loãng bằng pha động. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml, thêm pha động đến vạch. Lọc qua màng 0,45 Ịxm. Điều kiện sắc kỷ: Cột Phenomenex Ci8 (4,6 mm 25 cm) Pha động: dung dịch acid citric 0,1% : tetrahydroíìiran (6:4) Tốc độ dòng Iml/phút Detector 420 nm Thể tích tiêm mẫu: 20 |il Tính hàm lượng curcuminoid trong mẫu thử F ị= x mr " x 100 Sf X ìĩir, X Fr x / j 13 Trong đó: Ft , Fc là hàm lượng phần trăm curcuminoid trong mẫu thử, mẫu chuẩn(%) St, Sc là diện tích pic của curcuminoid trong mẫu thử, mẫu chuẩn nit ,nic là khối lượng mẫu thử, mẫu chuẩn (g) f t, fc là hệ số pha loãng của mẫu thử, mẫu chuẩn 2.3.3. Xác định một số thông sổ chiết xuất Xác đinh khả nâng hòa tan curcuminoid của dung mỏi chiết Cân khoảng 0,50 g curcuminoid chuẩn cho vào bình nón. Thêm 5 ml dung môi. Siêu âm khoảng 30 phút. Lọc lấy dịch. Hút chính xác Iml dịch, pha loãng f (lần) thích hợp. Lọc qua màng 0,45 Ịim rồi định lượng bằng HPLC Độ tan của curcuminoỉd trong 1 ml dung môi: Sf X c, X / ^ _ /m.g \ ■' X l o o o ( ^ ) ^ ml > Xác đinh thời điểm cân bằng chiết Chiết a (g) dược liệu hàm lượng curcuminoid Ft (%) với V ( ml) dung môi trong điều kiện xác định Sau mỗi khoảng thời gian lấy chính xác một thể tích dịch chiết đem pha loãng ft lần và định lượng hàm lượng curcuminoid chiết được theo thời gian bằng HPLC. Từ đó tính được hiệu suất chiết curcuminoid theo thời gian Hiệu suất chiết curcumỉnoỉd theo thời gian: SịXC.xũxV 5^ X a X _ 14 Thời điểm cân bằng là thời điểm hiệu suất chiết curcuminoid không tăng thêm (Lcb) Xác đinh khối lương cắn Dịch chiết thu được đem cô đến cắn. cắn để trong bình hút hẩm khoảng 24 giờ sau đó đem cân xác định khối lượng mcắn Xác đinh hàm lương curcuminoid trong cắn L^Ị, Xa X Ff - (% ) 2.3.4. Phương pháp tinh chế - Sử dụng các dung môi thích họp để loại bớt tạp chất và kết tinh sản phẩm - Loại tạp chất màu bằng than hoạt
- Xem thêm -