Tài liệu Các phương pháp hóa lý trong kiểm nghiệm thuốc

ĐỀ TÀI Các phương pháp hóa lý trong kiểm nghiệm thuốc L/O/G/O 1 www.trungtamtinhoc.edu.vn CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Phần 1 Phần 2 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. 2 www.trungtamtinhoc.edu.vn PHẦN 1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN TỬ I Quang phổ hấp thụ UV-VIS II Quang phổ hồng ngoại (IR) III Quang phổ huỳnh quang 3 I. QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 1. Độ hấp thụ – Độ hấp thụ tuân theo định luật Lambert – Beer và được biểu diễn bằng phương trình sau: A= 𝟏 𝐋𝐠 𝐓 = 𝐈𝟎 𝐥𝐠 𝐈 = 𝐊𝐂𝐋 Trong đó: T : Độ truyền qua. I0 : cường độ ánh sáng đơn sắc tới. I : cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch. K : hệ số hấp thụ phụ thuộc λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ. L : là chiều dài của lớp dung dịch. C : nồng độ chất tan trong dung dịch. 4 www.trungtamtinhoc.edu.vn 2. ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG: 1 Ánh sáng phải đơn sắc 2 Khoảng nồng độ phải thích hợp: định luật Lambert- beer chỉ đúng trong một giới hạn nhất định của nồng độ. 3 Dung dịch phải trong suốt 4 Chất thử phải bền trong dung dịch và bề dưới tác dụng của ánh sáng UV VIS 5 www.trungtamtinhoc.edu.vn 3. MÁY QUANG PHỔ Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ ở vùng tử ngoại và khả kiến gồm một hệ quang học có khả năng tạo ánh sáng đơn sắc trong vùng từ 200 đến 800nm và một thiếp bị thích hợp để đo độ hấp thụ. 6 www.trungtamtinhoc.edu.vn 4. HIỆU CHỈNH MÁY QUANG PHỔ Kiểm tra thanh độ dài sóng. HIỆU CHỈNH Kiểm tra độ hấp thụ. Giới hạn ánh sáng lạc Độ phân giải Độ rộng giải phổ nguồn. Cuvet. 7 www.trungtamtinhoc.edu.vn 5. ỨNG DỤNG CỦA PHỔ UV-VIS TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC  Định tính và khử tinh khiết: các cực đại hấp thụ là đặc trưng định tính của các chất.  Định lượng: chọn điều kiện xây dựng quy trình định lượng. 1 Chọn bước sóng hoặc kính lọc 2 Chọn khoảng nồng độ thích hợp 3 Chọn các điều kiện khác: loại trừ ảnh hưởng của chất lạ, chọn pH và dung môi thích hợp, thực hiện phản ứng màu,.. 8 www.trungtamtinhoc.edu.vn Các phương pháp định lượng: Phương pháp đo phổ trực tiếp: − Đo phổ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng: A = E1%1cm .L.C L = 1cm  C = 𝐴 𝐸1%1𝑐𝑚  Để áp dụng phương pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ cả về bước sóng lẫn độ hấp thụ.  Phương pháp gián tiếp: phương pháp đường chuẩn, so sánh thêm chuẩn. Đặc điểm của phương pháp gián tiếp:  Phải có chất chuẩn để so sánh.  Có thể không cần phải chuẩn máy. 9 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Phương pháp so sánh: theo định luật Lambert- beer suy ra: Cx = 𝐴𝑋 Cs 𝐴𝑠 Trong đó: Ax là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử có nồng độ Cx. As là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ Cs.  Chú ý: các nồng độ của dung dịch thử Cx và Cs không chênh lệch nhau quá nhiều. 10 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Phương pháp thêm chuẩn so sánh: 𝐴𝑥 𝐶𝑥 𝐴′𝑥 = 𝐶𝑠 + 𝐶𝑥  Trong đó: 𝐴𝑥 ∶ độ hấp thụ của dung dịch thử. 𝐴′𝑥 : độ hấp thụ của dung dịch chuẩn đã thêm chuẩn. 𝐶𝑠 : nồng độ của dung dịch chuẩn.  Phương pháp đường chuẩn: Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A= f (C) 11 www.trungtamtinhoc.edu.vn II. Quang phổ hồng ngoại 1. MỞ ĐẦU − Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử, ở các số sóng khác nhau. − Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR thường là 600 – 4000cm-1. 12 www.trungtamtinhoc.edu.vn 2. Máy quang phổ hấp thụ IR Máy quang phổ ghi phổ trong vùng hồng ngoại bao gồm một hệ quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong giải phổ từ 4000cm-1 - 670cm-1 và một phương tiện đo tỉ số giữa cường độ ánh sáng truyền qua và ánh sáng tới. Máy quang phổ hấp thụ IR 13 www.trungtamtinhoc.edu.vn 3. Ứng dụng phổ hồng ngoại trong định tính  Hầu hết các dược điển trên thế giới đều dựa trên 2 nguyên tắc: − So sánh sự phù hợp giữa chất thử với phổ chuẩn cho sẵn trong sách tra cứu hoặc trong thư viện phổ lưu giữ trong máy tính. − So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ của hóa chất chuẩn được ghi trong cùng điều kiện. • Định tính sử dụng chất chuẩn so sánh: • Định tính sử dụng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư viện phổ:  Chuẩn hóa độ phân giải.  Chuẩn hóa thang số sóng. 14 www.trungtamtinhoc.edu.vn III. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG (FLUOROMETRY) 1. MỞ ĐẦU Khái niệm: phổ huỳnh quang là phương pháp phổ phát xạ phân tử. Sau khi hấp thụ năng lượng của bức xạ tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức xạ kích thích), phân tử bị kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang. F = K.I0.𝜀.∅.C.L Ở đây: K : Hằng số I0 : Cường độ của bức xạ kích thích ∅ : Hiệu xuất huỳnh quang ∅= 𝑆ố 𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛 𝑝ℎá𝑡 𝑥ạ 𝑆ố 𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛 ℎấ𝑝 𝑡ℎụ (0< ∅<1) 𝜀 : hệ số hấp thụ mol của chất ở bước sóng kích thích. Rút gọn lại ta có : F = K’ . C Ở đây K’ = K.I0.𝜀.L.∅ 15 III. Quang phổ huỳnh quang (Fluorometry) Nguồn sáng 2. MÁY Bộ đơn sắc Cuvet Thường dùng đèn xenon,laser. Dùng cách tử Thường dùng thạch anh (1x1 cm) có 4 mặt trong suốt 16 www.trungtamtinhoc.edu.vn 3. CHUẨN HÓA MÁY Máy quang phổ huỳnh quang phải được chuẩn hóa thường xuyên với chất chuẩn. 4. PHƯƠNG PHÁP ĐO Kiểm tra vùng tuyến tính của Mẫu thử luôn cường độ huỳnh được đo so quang và điều chỉnh sánh với mẫu độ nhạy của thiết bị với độ pha loãng chuẩn. thích hợp của dung dịch chuẩn. Ghi cường độ huỳnh quang của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và các mẫu trắng tướng ứng của chúng. 17 www.trungtamtinhoc.edu.vn 4. PHƯƠNG PHÁP ĐO Tính toán nồng độ của dung dịch thử: Cx = 𝐼𝑋 −𝐼𝑂𝑋 Cs 𝐼𝑠 −𝐼𝑜𝑠 Ở đây: Cx : nồng độ của dung dịch thử Cs : nồng độ của dung dịch chuẩn Ix : trị số đo được của dung dịch thử Is : trị số đo được của dung dịch chuẩn Iox và Ios : trị số đo được của các mẫu trắng tương ứng. Trong đó 𝐼𝑋 − 𝐼𝑂𝑋 - (𝐼𝑠 − 𝐼𝑜𝑠) phải không được < 0,5 và không > 2. 18 www.trungtamtinhoc.edu.vn PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Định nghĩa: Là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột. Nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. 1. CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ  Hệ số dung lượng k’ k’ = 𝑉𝑠 K 𝑉𝑚 = 𝑄𝑠 𝑄𝑚 = 𝑡 ′𝑅 𝑡0 Trong đó: K : hệ số phân bố tR: thời gian lưu t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh t0: thời gian chết = 𝑡𝑅 −𝑡0 𝑡0 Qm: lượng chất trong pha động vs: thể tích pha tĩnh Vm: thể tích pha động Qs: lượng chất trong pha tĩnh 19 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Hệ số chọn lọc 𝜶: Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột. 𝛼= 𝑘′𝐵 𝑘′𝐴 = 𝑡𝑅𝐵 𝑡𝑅𝐴 Quy ước ở đây B là chất bị giữ mạnh hơn A nên 𝛼 > 1. Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ 𝛼 ≤2.  Hệ số đối xứng của pic F: F= 𝑊 2𝑎 Ở đây: W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic 20 www.trungtamtinhoc.edu.vn