Tài liệu Các kỹ thuật elisa

TIỂU LUẬN CÁC KỸ THUẬT ELISA 1 1. Đặt vấn đề: Trong các nghiên cứu thí nghiệm, thực nghiệm cũng như thực tế phát hiện và điều trị các bệnh lý trên người, động vật và thực vật, lĩnh vực chẩn đoán luôn đóng một vai trò thiết yếu. Trong số những kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán, không thể không kể đến ELISA. ELISA là kỹ thuật được sử dụng rất rộng rãi trong y dược, thú y và bệnh lý thực vật, và cho đến nay vẫn là một trong những phương pháp chẩn đoán quan trọng nhất trong miễn dịch học cũng như một số lĩnh vực khác. Qua quá trình phát triển, nghiên cứu và ứng dụng thực nghiệm, ELISA đã có nhiều cải tiến và biến đổi, phân thành nhiều kỹ thuật nhỏ nhằm phù hợp cho từng trường hợp, từng điều kiện, từng đối tượng cụ thể. Sự đa dạng của ELISA dẫn đến sự cần thiết phải có một cái nhìn tổng thể, bao quát và so sánh cụ thể từng biến thể của ELISA nhằm lựa chọn và sử dụng các kỹ thuật trên một cách phù hợp nhất cho từng hoàn cảnh. Đó chính là mục đích của bài viết này. 2. Tổng quan: Enzyme-linked immunosorbent assay, hay còn gọi là ELISA, enzyme immunoassay hay EIA là kỹ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch học rất phổ biến trong rất nhiều lĩnh vực, từ y học, y dược, thú y, sinh học, kiểm định thực phẩm, môi trường v.v… ELISA phổ biến rộng rãi nhờ vào những đặc tính có lợi cho thực nghiệm của nó: dễ thực hiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp, dễ sản xuất, an toàn với độ nhạy và độ đặc hiệu chấp nhận được. Tiền thân của ELISA là kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay – RIA), được phát triển bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Aaron Berson (xuất bản lần đầu tiên năm 1960; Nobel y học cho Rosalyn S. Yalow năm 1977). Mặc dù phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên việc đánh đấu bằng phóng xạ yêu cầu kỹ thuật cao, phức tạp, tốn kém, cũng như việc sử dụng phải vô cùng cẩn thận vì khả năng gây nguy hiểm của phóng xạ đã đưa đến nhu cầu tìm kiếm các phương pháp cải tiến thay thế. Để thay cho việc sử dụng chất đánh dấu phóng xạ, người ta đã sử dụng kỹ thuật liên kết kháng nguyên hoặc kháng thể với một enzyme (enzyme-linked) có khả năng thực hiện một phản ứng nhận biết (ví dụ như gây đổi màu một chất). Quy trình liên kết enzyme được phát triển độc lập bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce. Bên cạnh đó, việc cần phải loại bỏ các kháng nguyên/kháng thể thứ cấp không gắn dẫn tới kỹ thuật cố định các kháng nguyên/kháng thể sơ cấp (immunosorbent) được công bố bởi Wide và Jerker Porath năm 1966. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập công bố các bài báo tổng hợp các kỹ thuật trên thành ELISA. 3. ELISA – nguyên lý cơ bản và các biến thể: 3.1. Nguyên lý cơ bản: Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỗi một kháng nguyên (antigen) có nhiều yếu tố kháng nguyên (epitope), mỗi một epitope có khả năng kết hợp với một kháng thể (antibody) tương ứng với nó. Hầu hết các kháng nguyên đều có một hoặc vài epitope đặc trưng cho nó, dựa trên đó mà người ta có thể xác định được kháng nguyên. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của kháng nguyên trong cơ thể trong một số trường hợp có khả năng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu để chống lại kháng nguyên đó. Thông qua việc xác định kháng thể này người ta cũng có thể gián tiếp xác định kháng nguyên trong cơ thể. 2 Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA được thiết lập nhằm chẩn đoán sự hiện diện của một kháng nguyên hay kháng thể. Để xác định một yếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên/kháng thể) người ta sử dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện (kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có phản ứng miễn dịch đặc hiệu với yếu tố cần chẩn đoán. Các yếu tố phát hiện này được đánh dấu bằng enzyme sao cho phản ứng miễn dịch với yếu tố cần chẩn đoán sẽ tạo nên sự thay đổi có thể nhận biết được bằng mắt thường hay thậm chí định lượng được bằng các công cụ so màu khác khi cho cơ chất của enzyme đánh dấu vào. 3.2. Các biến thể của ELISA: Mặc dù nguyên tắc của ELISA khá đơn giản, nhưng qua quá trình thực nghiệm sử dụng đã vấp phải khá nhiều vấn đề, từ các vấn đề về hiệu quả của phương pháp như độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện cho đến những vấn đề về thực nghiệm như thời gian thực hiện, độ phức tạp, chi phí cũng như khả năng hệ thống hóa thành bộ dụng cụ (KIT) để sản xuất công nghiệp. Chính vì vậy, người ta đã không ngừng cải tiến phương pháp này, đưa ra nhiều phương pháp mới phù hợp với từng điều kiện, từng đối tượng khác nhau. Cho đến nay, đã có rất nhiều biến thể đa dạng của ELISA. Tuy nhiên nhìn chung, tất cả các biến thể này có thể được phân loại như sau: • ELISA dị pha (heterogeneous), hay còn gọi là ELISA pha rắn (solid phase), gồm các phương pháp: - ELISA trực tiếp (direct ELISA) - ELISA gián tiếp (indirect ELISA) - ELISA sandwich - ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) • ELISA đồng pha (homogeneous), gồm các phương pháp ELISA đồng pha cạnh tranh (competitive) và không cạnh tranh (non-competitive). Trong giới hạn bài viết này, chỉ có thể khái quát về phương pháp chung cho từng loại biến thể trên. Trong thực nghiệm chẩn đoán, cần có những điều chỉnh thích hợp đối với từng quy trình cụ thể cho từng đối tượng khác nhau. Các ký hiệu quy ước trong các phần sau: ] Bề mặt rắn Ag Kháng nguyên mẫu. Ở đây quy ước là những yếu tố cần xác định trong mẫu có mang các yếu tố kháng nguyên (epitope) và có thể là một loại kháng thể. Agc Kháng nguyên cạnh tranh Ab Kháng thể E Enzyme AAb Kháng kháng thể . Liên kết giữa chất cần đánh dấu và chất đánh dấu = Liên kết với bề mặt rắn – Liên kết miễn dịch 3.2.1. ELISA dị pha: Trong ELISA dị pha, các yếu tố cần chẩn đoán được tách ra khỏi hỗn hợp dung dịch mẫu bằng cách cố định lên một bề mặt rắn (có thể là nhựa, thủy tinh, giấy, màng nitrocellulose, agarose, polyacrylamide gel hay thậm chí vi khuẩn được cố định) tạo thành hai pha cố định và tự do, theo sau là môt bước loại bỏ pha tự do. Yếu tố phát hiện được thêm vào sau đó để phát hiện sự hiện diện của yếu tố cần chẩn đoán còn lại trên pha cố định thông qua hoạt tính của enzyme. Các phương pháp cố định các yếu tố lên bề mặt rắn và loại bỏ pha tự do sẽ được đề cập đến trong phần 4.1. 3 3.2.1.1. ELISA trực tiếp: Phương pháp này ít được sử dụng trong ELISA định lượng mà thường được sử dụng cho ELISA định tính. Yếu tố cần chẩn đoán (ví dụ như kháng nguyên) được cố định trực tiếp lên một bề mặt rắn và sau đó được xác định sự hiện diện bằng yếu tố phát hiện. Phương pháp có thể được mô tả tổng quát qua sơ đồ sau: ] = Ag + Ab . E → ] = Ag – Ab . E Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…). Tuy nhiên, nhược điểm của nó là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn. Việc đánh dấu từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau. Ngoài ra, phương pháp này cũng có giới hạn phát hiện cao, và cần một lượng lớn các yếu tố cần chẩn đoán do sự liên kết kém hiệu quả của yếu tố này lên bề mặt rắn cũng như sự cạnh tranh của các protein khác trong quá trình phản ứng miễn dịch. 3.2.1.2. ELISA gián tiếp: Phương pháp ELISA gián tiếp tương tự như ELISA trực tiếp, nhưng ở đây người ta sử dụng tới hai lớp yếu tố phát hiện, và chỉ có lớp yếu tố phát hiện cuối cùng mới mang enzyme. Sơ đồ phương pháp gồm những bước như sau: ] = Ag + Ab + AAb . E → ] = Ag – Ab – AAb . E Ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau. Kháng thể sơ cấp cũng là những protein, và cũng mang những epitope của riêng nó. Nếu nhiều loại kháng thể khác nhau được sản xuất từ cùng một loài sinh vật, tất cả các loại kháng thể này đều mang những epitope chung đặc trưng cho loài đó. Việc sản xuất một kháng kháng thể có khả năng liên kết với epitope đó là hoàn toàn có thể, thông qua việc tiêm các kháng thể trên vào một loài sinh vật khác. Phương pháp này cũng cho giới hạn phát hiện thấp hơn khoảng 10 lần so với ELISA trực tiếp, do khả năng liên kết nhiều kháng kháng thể lên một phân tử kháng thể sơ cấp, làm tăng số lượng enzyme được cố định. Tuy nhiên nhược điểm của nó là tăng số bước thực hiện do đó làm tăng việc kiểm soát các điều kiện quá trình và kéo dài thời gian chẩn đoán. Nhằm tăng khả năng phát hiện, người ta có thể sử dụng kỹ thuật nối cầu (brigde) bổ trợ cho ELISA gián tiếp. Về nguyên tắc, kỹ thuật brigde cũng tương tự như ELISA gián tiếp, nhưng ở đây sử dụng nhiều lớp yếu tố phát hiện hơn (trên hai lớp). Qua mỗi lớp yếu tố phát hiện, tín hiệu lại được khuếch đại lên vài lần. Tuy nhiên cần lưu ý là càng nhiều lớp yếu tố phát hiện, số bước thực hiện càng nhiều và sẽ kéo dài thời gian, tăng thêm việc kiểm soát điều kiện cho từng quá trình, cũng như tăng khả năng liên kết chéo giữa các yếu tố phát hiện với nhau. Các kỹ thuật brigde sẽ được liệt kê trong phần 4.2. 3.2.1.3. ELISA sandwich: Tương tự như ELISA trực tiếp và gián tiếp, trong phương pháp này yếu tố cần chẩn đoán cũng được cố định lên bề mặt rắn. Tuy nhiên việc cố định này không được thực hiện trực tiếp mà thông 4 qua liên kết miễn dịch với một yếu tố phát hiện (thường là kháng thể) đã được gắn cố định sẵn trên bề mặt rắn. Sơ đồ tổng quát như sau: → ] = Ab1 + Ag + Ab2 . E ] = Ab1 – Ag – Ab2 . E Sau khi bắt giữ yếu tố cần chẩn đoán, lúc này phương pháp quay lại tương tự như ELISA trực tiếp và gián tiếp sau khi đã cố định yếu tố cần chẩn đoán. Người ta có thể sử dụng một kháng thể liên kết enzyme để xác định trực tiếp yếu tố trên (như ELISA trực tiếp), hoặc cũng có thể dùng một trong số các phương pháp brigde của ELISA gián tiếp. Bên cạnh kháng thể người ta cũng có thể cố định một số yếu tố khác lên mặt rắn như Clq, receptor, lectin… Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm vượt trội, thứ nhất là giảm được nhuộm màu nền và các phản ứng không đặc hiệu do đã loại bỏ được hầu hết các thành phần tạp, phản ứng được thực hiện dễ dàng hơn, Ab1 có thể được gắn sẵn trên bề mặt rắn tạo thành các bộ KIT và có thể thực hiện các chẩn đoán mà trong đó kháng nguyên không thể gắn được lên mặt rắn. Bên cạnh đó nó cũng có những nhược điểm riêng, quan trọng nhất là làm tăng phản ứng chéo do liên kết không đặc hiệu giữa các lớp yếu tố phát hiện thứ cấp với Ab1. Nhược điểm này đã được nghiên cứu khắc phục bằng cách chỉ cố định phần đoạn nhánh (Fab) của kháng thể. Tuy nhiên việc làm này có thể làm giảm độ đặc hiệu của kháng thể trong xét nghiệm kháng thể đối với các loại virus có quan hệ về huyết thanh học (Koenig, 1981; Rybycki và von Wechmar, 1981; Koenig và Paul, 1982). 3.2.1.4. ELISA cạnh tranh: ELISA cạnh tranh là phương pháp ELISA rất hiệu quả cho định lượng các yếu tố hiện diện trong mẫu với lượng nhỏ. ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên mà ta muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với cùng một loại kháng thể đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lượng kháng nguyên cạnh tranh này thông qua hoạt tính enzyme được liên kết với nó. Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngược lại. Có ba biến thể chính của phương pháp này: - Phương pháp bão hòa cân bằng tương đối (quasi-equilibrium saturarion): ] = Ab – Ag ] = Ab + Ag + Agc . E → ] = Ab – Agc . E Trong phương pháp này kháng nguyên mẫu (Ag) và kháng nguyên cạnh tranh (Agc) được cho phản ứng cùng lúc với một kháng thể được cố định. Hai loại kháng nguyên sẽ phản ứng miễn dịch với Ab theo một tỉ lệ tương ứng với tỉ lệ nồng độ giữa hai loại kháng nguyên, từ đó có thể xác định được nồng độ Ag khi đo tỉ lệ Agc còn lại sau phản ứng với lượng Agc sử dụng ban đầu. Cần lưu ý là lượng kháng nguyên cạnh tranh phải được biết trước và phải dư để có thể bão hòa hết lượng kháng thể. - Phương pháp bão hòa thứ tự (sequential saturation): ] = Ab – Ag ] = Ab + Ag → ] = Ab – Ag + Agc . E ] = Ab → ] = Ab – Agc . E 5 Phương pháp này thường được sử dụng hơn bão hòa cân bằng tương đối. Khác với phương pháp trên, với bão hòa thứ tự kháng nguyên mẫu được cho phản ứng trước. Sau đó, một lượng dư kháng nguyên cạnh tranh được thêm vào để bão hòa lượng kháng thể còn trống. Hoạt tính enzyme đo được sẽ cho biết lượng Agc phản ứng với kháng thể còn trống, từ đó tính được lượng Ag đã chiếm chỗ kháng thể. Trong phương pháp này, lượng Agc ban đầu không cần phải biết trước, tuy nhiên vẫn cần phải dư để bão hòa lượng kháng thể còn lại. Một biến thể của phương pháp này đó là kháng thể Ab không được cố định trước, mà sau khi phản ứng lần lượt với kháng nguyên mẫu Ag và kháng nguyên cạnh tranh Agc sẽ được cố định lại bằng cách phản ứng với kháng kháng nguyên AAb được cố định trên mặt rắn. Ab – Ag Ab + Ag → Ab – Ag + Agc . E → Ab + ] = AAb Ab – Agc . E ] = AAb – Ab – Ag → ] = AAb – Ab – Agc.E - Phương pháp ức chế kháng thể (antibodies inhibition): Thay vì cố định kháng thể lên mặt rắn, người ta cũng có thể cố định kháng nguyên cạnh tranh. Đầu tiên, người ta sẽ cho kháng nguyên mẫu phản ứng với một lượng kháng thể biết trước. Sau đó, lượng kháng thể còn lại chưa phản ứng sẽ được phản ứng với kháng nguyên cạnh tranh, và được cố định lại. Sau bước rửa ta có thể đo lượng kháng thể còn cố định lại và suy ra lượng kháng thể đã phản ứng với kháng nguyên mẫu. Ag – Ab . E Ag + Ab . E → Ag – Ab . E + Ab . E ] = Agc → ] = Agc – Ag . E Bên cạnh việc định lượng kháng nguyên, phương pháp này còn có thể sử dụng để so sánh các kháng nguyên với nhau, như Altschuh và van Regenmortel (1982) đã dùng để nghiên cứu các epitope khác nhau trên protein vỏ virus khảm thuốc lá. 3.2.2. ELISA đồng pha: Phương pháp này thường được sử dụng để định lượng các phân tử nhỏ. Khác với RIA và ELISA dị pha, phương pháp này không cần bước tách biệt các yếu tố gắn kết và tự do, vì nó dựa trên sự thay đổi hoạt tính của enzyme thông qua phản ứng liên kết miễn dịch. Ưu điểm lớn của phương pháp này là giảm được mức độ phức tạp của phản ứng trong việc cố định các yếu tố lên bề mặt rắn, thời gian thực hiện rất nhanh cũng như giảm được lượng kháng thể cần dùng vì không phải tráng một bề mặt rắn lớn. Tuy nhiên nó có nhược điểm là hầu hết các 6 phương pháp làm thay đổi hoạt tính enzyme cho đến nay đều dựa trên sự thay đổi về cấu trúc không gian của các yếu tố gắn kết với enzyme (phần 4.3). Hướng đi này cần có những thiết kế chính xác về cấu trúc không gian của các thành phần, một yêu cầu khá phức tạp, tốn kém, hầu hết chỉ có thể áp dụng được với các kháng nguyên nhỏ và gây rất nhiều hạn chế trong việc sản xuất các thành phần của một phản ứng ELISA. Đây cũng là yếu tố chính đã giới hạn rất lớn kỹ thuật ELISA đồng pha. Ngoài ra, kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác trong mẫu có khả năng làm biến đổi hoạt tính enzyme. 3.2.2.1. ELISA đồng pha không cạnh tranh: Phương pháp này đơn giản sử dụng enzyme liên kết với kháng thể sao cho phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ thay đổi hoạt tính của enzyme (phương pháp của Ngo và Lenhoff, 1981 hay phương pháp của Wei và Reibe, 1977). 3.2.2.2. ELISA đồng pha cạnh tranh: Đây là phương pháp ELISA đồng pha được sử dụng nhiều nhất. Về mặt miễn dịch phương pháp tương tự như ELISA dị pha cạnh tranh, với sự cạnh tranh giữa kháng nguyên mẫu và kháng nguyên cạnh tranh. Ở đây kháng nguyên cạnh tranh có thể được đánh dấu với enzyme, cơ chất của enzyme, cofactor, inhibitor, v.v… Còn về mặt biến đổi hoạt tính enzyme có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng, sẽ được điểm qua trong phần 4.3. 4. Các biến thể trong các kỹ thuật bổ trợ khác cho ELISA: Trong phần này sẽ đề cập đến một số kỹ thuật bổ trợ khác trong các phương pháp kể trên của ELISA. Các kỹ thuật này không nhất thiết cố định cho từng loại ELISA mà có thể kết hợp tự do tùy theo nhu cầu và thiết kế của thí nghiệm chẩn đoán. 4.1. Các kỹ thuật cố định các yếu tố miễn dịch lên bề mặt rắn trong ELISA dị pha: Chọn lựa bề mặt rắn thích hợp là nhân tố quan trọng trong việc cố định các yếu tố miễn dịch. Một bề mặt rắn cần thõa mãn các yêu cầu sau: Khả năng gắn kết số lượng lớn các yếu tố miễn dịch (tỉ lệ bề mặt/thể tích cao), khả năng cố định được nhiều loại yếu tố khác nhau, tối thiểu sự phân tách ngược lại các yếu tố đã cố định, mức độ phân hủy các phân tử cố định không đáng kể, định hướng kháng thể cố định với hai đầu gắn kết quay lên trên và phần thân gắn xuống mặt rắn. Có nhiều bề mặt rắn đã được thử nghiệm sử dụng trong ELISA dị pha: nhựa, thủy tinh, màng nitrocellulose và giấy, agarose, cellulose, vi khuẩn cố định… Trong phần này sẽ sơ lược qua từng loại bề mặt rắn và các phương pháp chung để cố định các yếu tố lên các bề mặt rắn này. 4.1.1. Nhựa: Cho đến nay nhựa là bề mặt rắn được sử dụng phổ biến nhất, nhờ vào quy trình cố định rất đơn giản. Tuy nhiên, nhựa có một số nhược điểm quan trọng: tốn lượng lớn các yếu tố cố định, làm giảm ái lực của kháng thể cố định với các kháng nguyên lớn, tốc độ phản ứng miễn dịch chậm (hàng giờ thay vì vài phút so với các yếu tố trong dung dịch), lượng yếu tố gắn kết trên một đơn vị diện tích thấp. Có nhiều dạng bề mặt rắn làm từ nhựa: dạng hạt, đĩa, ống, que, dạng đầu diêm… Trong số đó, dạng phổ biến nhất là dạng tấm chứa 12 x 8 giếng 0,3 ml làm từ polystyrene hoặc polyvinylchloride (PVC). 7 Hình 1: Tấm nhựa chứa 12 x 8 giếng dùng trong ELISA 4.1.1.1. Cố định bằng liên kết không cộng hóa trị: Phương pháp này cố định bằng cách ủ bề mặt rắn với yếu tố cần cố định được hòa tan trong dung môi với điều kiện nhiệt độ và nồng độ nhất định. Bản chất của liên kết chưa được hiểu rõ, tuy nhiên liên kết này kém bền và trong quá trình thực hiện ELISA, nếu không có những biện pháp thích hợp, yếu tố được cố định có thể sẽ phân tách ngược trở lại. Có nhiều buffer được sử dụng: 50 mM carbonate, pH 9,6; 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 bổ sung 100 mM NaCl; PBS, chứa 10 mM sodium phosphat buffer, pH 7,2, bổ sung 100 mM NaCl hay cũng có thể dùng dung dịch saline hay nước khử ion. Nên tránh các chất không phân cực như Triton X-100 hay Tween 20 vì chúng có thể cạnh tranh rất mạnh với các protein trong liên kết với mặt rắn. Điều kiện thường được sử dụng là ủ qua đêm ở 4oC trong tủ giữ ẩm. Tuy nhiên có thể giảm thời gian ủ bằng cách tăng nhiệt độ, tăng nồng độ yếu tố cần cố định hoặc thay đổi pH. 4.1.1.2. Cố định bằng liên kết cộng hóa trị: Phương pháp này rất thuận tiện cho việc sản xuất một lượng lớn bề mặt rắn tráng các yếu tố miễn dịch, cũng như cần thiết để cố định các yếu tố miễn dịch hấp thụ kém lên bề mặt rắn. Một quy trình đơn giản dùng được cho hầu hết các yếu tố chứa nhóm amino tự do như oligopeptide hay hapten là xử lý nhựa polystyrene với glutaraldehyde (Barrett, 1977), giảm pH xuống khoảng 5 để hoạt hóa polystyrene kết dính với GA. Sau khi cho yếu tố miễn dịch vào, tăng pH lên 8 hoặc 9,5 để hoạt hóa GA tạo liên kết với yếu tố miễn dịch. 4.1.1.3. Cố định bằng kỹ thuật bridge: Người ta có thể sử dụng một số phân tử vừa có ái lực mạnh với nhựa vừa có khả năng liên kết các yếu tố miễn dịch làm trung gian để liên kết các yếu tố này với bề mặt nhựa. Skurrie và Gilbert (1983) đã tráng bề mặt nhựa với albumin huyết thanh bò, và sử dụng lớp tráng này để cố định kháng nguyên rubella. Một số phân tử tích điện dương có thể được sử dụng làm cầu để cố định DNA mạch đôi. Khác với DNA mạch đơn, DNA mạch đôi hấp thụ rất kém lên polystyrene. Klotz (1982) đã dùng dung dịch protamine sulfate 1% xử lý bề mặt polystyrene. Một số hợp chất tích điện dương khác cũng được sử dụng như MBSA (Ferrua và cộng sự, 1983) hay poly-L-lysiyne (Leipoid và cộng sự, 1983) 8 4.1.2. Màng nitrocellulose và giấy: Dạng màng nitrocellulose rất phổ biến trong nghiên cứu về acid nucleic, tuy nhiên cũng đang trở nên thông dụng trong protein blotting. Ưu điểm lớn nhất của loại màng này là cần rất ít các yếu tố miễn dịch để cố định, ít hơn 1 μl dung dịch có thể được sử dụng và làm khô trên bề mặt màng, giới hạn khu vực bám của các yếu tố trong vòng đường kính nhỏ hơn 1 mm. Những khu vực khác có thể được khóa bằng protein trơ hay các hóa chất che phủ khác. Một ưu điểm khác là kháng nguyên có thể bám được trên loại màng này dù kém hơn khi có mặt các hóa chất không phân cực như Tripton X-100 hay Tween. Hình 2: Màng nitrocellulose dùng trong ELISA 4.1.2.1. Dot protein lên màng: Phương pháp vô cùng đơn giản là sử dụng micropipete nhỏ dung dịch thành giọt trên màng, đợi cho khô rồi tiếp tục nhỏ liên tiếp nhiều lần, sau đó là một bước hấp nóng giúp ổn định liên kết protein lên màng. Thay vì sử dụng các chất che phủ các vị trí trống như BSA hay gelatin, người ta cũng có thể thêm Tween 20 0,5% trong dung dịch chứa các yếu tố miễn dịch để ngăn cản các liên kết không đặc hiệu. 4.1.2.2. Gắn các kháng nguyên tan trong chất tẩy rửa lên đĩa nitrocellulose: Những đĩa nhỏ đường kính khoảng 4 mm được dập trên màng nitrocellulose được thả nổi trên nước cất để làm ướt. Màng ướt được đặt trên giấy thấm và cho 10 – 20 μl mẫu. Đĩa sau đó được làm khô và ủ với các chất che phủ để khóa các vị trí trống. Nếu sử dụng Triton X-100, cần cố định đĩa với GA nhằm tránh sự phân tách ngược lại của protein. 4.1.2.3. Liên kết cộng hóa trị trên giấy: Quy trình của Ceska và Lundkvist (1972) để liên kết kháng thể lên giấy sử dụng các đĩa đường kính 6 mm dập trên giấy cellulose. Quy trình gồm hai bước: kích hoạt giấy với cyanogen bromide (CNBr) và liên kết các yếu tố lên giấy. Để kích hoạt giấy, ngâm đĩa giấy vào nước cất trong 3 phút, sau đo thêm 600 ml dung dịch cyanogen bromide (CNBr), tăng pH ngay lập tức lên 10,5 và giữ ổn định pH này trong 30 phút. Cuối cùng rửa và sấy khô ở nhiệt độ phòng và trữ ở 4oC. Bước liên kết được thực hiện với việc hòa tan 4 ml yếu tố miễn dịch tinh sạch trong 40 ml NaHCO3 100 mM ở 4oC. Thêm 1 g đĩa giấy đã kích hoạt vào và khuấy nhẹ trong 3 giờ ở 4oC. Rửa sạch ở nhiệt độ phòng. 9 Phương pháp này cho mức độ hấp thụ các yếu tố miễn dịch gấp 5 – 10 lần so với phương pháp liên kết không cộng hóa trị lên nhựa, và mức độ phân tách ngược lại chỉ khoảng 13% 4.1.3. Thủy tinh: Yếu tố miễn dịch có thể được gắn lên phiến thủy tinh bằng cách gia nhiệt, cố định với formaldehyde hay liên kết bằng glutaraldehyde với que thủy tinh aminoalkylsilyn. Theo Conway de Macario và cộng sự (1983) để cố định kháng nguyên thành giọt, trước tiên rửa phiến kính với cồn 95o. Nhỏ một lượng kháng nguyên lên bề mặt phiến kính và cố định theo các phương pháp sau: - Với virus: làm khô bằng bốc hơi - Vi khuẩn và Archaebacteria: hơ nhanh mặt dưới phiến kính bằng đèn cồn ba lần - Tế bào động vật có vú: Sấy khô rồi nhỏ một giọt acetone lạnh - Kháng nguyên không cụ thể: để khô bằng bốc hơi rồi ủ 30 phút với phosphat buffer saline. Để liên kết yếu tố miễn dịch với que thủy tinh aminoalkylsilyn, có thể sử dụng quy trình của Robinson và cộng sự (1971), Hamaguchi và cộng sự (1976). Đun nóng que thủy tinh đường kính 3 mm, dài 5 mm ở 500oC trong 5 giờ. Sau đó ngâm 24 giờ trong dung dịch 3aminopropyltriethoxysilan 2% ở 45oC. Rửa lại với acetone và làm khô. Ngâm 1 giờ trong glutaraldehyde 1%, rửa lại với 250 mM sodium phosphat buffer, pH 7,5. Sau cùng ngâm trong dung dịch yếu tố miễn dịch cần cố định trong 30 phút rồi rửa lại với dung môi dùng cho ELISA. 4.1.4. Các bề mặt rắn khác: 4.1.4.1. Các cấu trúc ma trận: Các cấu trúc ma trận có đồng phân không gian như agarose, dextran, allyl dextrose hay cellulose có thể được kích hoạt bởi các chất oxy hóa như CNBr hay NaIO4, tạo gốc aldehyde có thể tạo liên kết Schiff base với nhóm animo tự do của protein. Agarose dưới dạng hạt (Sepharose) có những ưu điểm là yếu tố miễn dịch có thể được giữ dưới dạng treo, cấu trúc xốp giúp hấp thu kháng nguyên nhiều hơn (10 μl sepharose có thể hấp thu lượng kháng nguyên gấp 5 – 40 lần so với một đĩa giấy đường kính 6 mm và gấp 100 lần so với một giếng nhựa), mức độ hấp thu không đặc hiệu cũng ít hơn. Các loại bề mặt rắn khác như dextran, allyl dextrose hay cellulose còn có mức độ hấp thu yếu tố miễn dịch cao hơn cả agarose. Tuy nhiên dextran dễ bị phân hủy dưới tác dụng của các chất oxy hóa mạnh như NaIO4 4.1.4.2. Vi khuẩn chứa protein A (SpA): Protein A phân lập từ vách của Staphylococcus aureus có ái lực với phần thân (Fc) của nhiều kháng thể. S.aureus có thể được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) hoặc formalin để dùng cho ELISA. Quy trình của Lindmark (1982) cố định Staphylococci bằng cách đun trong nước sôi 2 phút, sau đó cho một lượng tương đương TCA 10% nóng và khuấy. Đun tiếp 90oC trong 6 phút rồi làm lạnh nhanh, sau đó ly tâm với potassium phosphat buffer, pH 7,4 để thu vi khuẩn cố định. 4.1.5. Phân tách pha cố định và pha tự do: Với các bề mặt rắn lớn (nhựa, thủy tinh, màng nitrocellulose và giấy), phương pháp phân tách đơn giản là hút hoặc rửa với một dung môi rửa thích hợp giúp phân tách các liên kết không đặc hiệu và giữ ổn định các liên kết đặc hiệu. Bước phân tách đơn giản này là một trong những nguyên nhân chính khiến các bề mặt rắn này phổ biến rộng rãi, dù mức độ hấp thụ các yếu tố miễn dịch của chúng thấp. 10 Các loại bề mặt rắn khác (hạt agarose, sephacryl, cellulose và vi khuẩn) có bề mặt hấp phụ lớn, cho phản ứng miễn dịch nhanh hơn, tuy nhiên cần phải sử dụng một số phương pháp phức tạp hơn để phân tách hai pha: ly tâm, lọc, dùng từ trường… 4.2. Các kỹ thuật brigde trong ELISA gián tiếp: Kỹ thuật brigde có thể hiểu đơn giản là kỹ thuật liên kết giữa yếu tố cần chẩn đoán và yếu tố phát hiện mang enzyme thông qua nhiều lớp yếu tố phát hiện trung gian. Các kỹ thuật brigde không chỉ giới hạn trong ELISA gián tiếp mà có thể dùng cho các phương pháp khác như ELISA sandwich hay ELISA cạnh tranh. Có ba phương pháp brigde chính thường sử dụng trong ELISA: 4.2.1. Brigde enzyme liên kết miễn dịch (immunologically linked enzyme), hay còn gọi là ELISA khuếch đại (amplified ELISA): ] = Ag + Ab1 + AAb + Ab2 . E → ] = Ag – Ab1 – AAb – Ab2 . E Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản và dễ sản xuất các thành phần, thậm chí có thể sử dụng enzyme thô. Độ nhạy được tăng cao, tuy nhiên có nhược điểm là AAb cần phải dư nếu không cả hai tâm phản ứng của nó sẽ gắn kết với Ab1 và không thể phản ứng với Ab2. 4.2.2. Brigde phức hợp biotin – avidin: Avidin là một protein bốn nhân có trong lòng trắng trứng các loài chim, bò sát và lưỡng cư. Mỗi nhân của avidin có khả năng liên kết khá đặc hiệu với biotin (vitamin H/vitamin B7). Người ta có thể sử dụng đặc điểm này để thực hiện phương pháp brigde: ] = Ag + Ab + AAb . biotin + avidin + biotin . E → ] = Ag – Ab – AAb . biotin – avidin – biotin . E Phương pháp này được sử dụng nhiều hơn phương pháp enzyme liên kết miễn dịch, do ưu điểm vượt trội là không bị giới hạn bởi loài, nhạy hơn và AAb liên kết biotin không cần phải ở lượng dư cũng như việc liên kết với biotin ít ảnh hưởng tới hoạt tính và khả năng hòa tan của AAb và enzyme. Tuy nhiên phương pháp này có một vài giới hạn, đó là avidin là một glycoprotein, và có khả năng phản ứng với các oligosaccharide, nhiễm sắc thể cô đặc hay protein chứa biotin khác có trong mẫu được cố định trên mặt rắn cùng với kháng nguyên, và gây sai lệch kết quả. 4.2.3. Brigde lectin: Tương tự như avidin và biotin, lectin cũng có thể được sử dụng trong phương pháp brigde. Concanavalin A được biết là có ái lực mạnh với POase (hydrogen-peroxide oxidoreductase). Sử dụng Con A làm cầu nối theo sơ đồ sau: ] = Ag + Ab . Con A + POase → ] = Ag – Ab . Con A – POase Tuy nhiên cần lưu ý là lectin cũng có ái lực với một số đường do đó cần ủ phức hợp Ab đánh dấu bằng lectin với một lượng dư đường đặc hiệu với lectin để tránh việc liên kết không đặc hiệu với các đường trên mặt rắn. Sau khi phản ứng miễn dịch với kháng nguyên, các đường này nên được rửa 11 khỏi lectin trước khi thêm enzyme. Phương pháp này cũng có độ nhạy kém hơn và không có ưu điểm gì vượt trội so với các phương pháp brigde khác. 4.3. Kỹ thuật biến đổi hoạt tính enzyme trong ELISA đồng pha: Nguyên tắc cơ bản của ELISA đồng pha là dựa trên sự thay đổi hoạt tính của enzyme đánh dấu sau khi có liên kết miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể. Để tạo ra sự biến đổi này, có một số phương pháp đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả khác nhau. Ngo và Lenhoff (1981) sử dụng hai kháng thể đặc hiệu với hai epitope khác nhau trên cùng một kháng nguyên, mỗi kháng thể được đánh dấu bằng một loại enzyme sao cho sản phẩm do enzyme này tạo ra sẽ là cơ chất của enzyme kia (ví dụ glucose oxidase như GOase và peroxidase như POase). Phản ứng liên kết miễn dịch sẽ mang hai enzyme lại gần nhau, từ đó tăng hoạt tính tương đối của enzyme. Phương pháp này được sử dụng cho ELISA đồng pha không cạnh tranh, tuy nhiên vẫn còn cần nhiều cải tiến để tín hiệu thể hiện rõ hơn. + Ag Ag Hình 3: Phương pháp của Ngo và Lenhoff (1981) Một phương pháp khác của Wei và Reibe (1977) gắn trực tiếp enzyme với kháng thể. Khi kháng nguyên liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ che lấp tâm hoạt động của enzyme, khiến enzyme không thể tiếp xúc cơ chất và làm giảm hoạt tính enzyme. Về mặt lý thuyết, phương pháp này có lợi điểm là có thể sử dụng cho các kháng nguyên có kích thước lớn, tuy nhiên cần thiết phải có một thiết kế chính xác về mặt cấu trúc không gian của kháng nguyên, kháng thể, enzyme và cơ chất. Thiết kế không thích hợp có thể làm cho kháng nguyên không che lấp hết tâm hoạt động của enzyme, hoạt tính của enzyme sẽ không giảm rõ rệt, trong khi đó nếu enzyme quá lớn có thể che lấp ngược lại kháng thể và ngăn cản kháng nguyên liên kết với kháng thể. + Ag Ag X Hình 4: Phương pháp của Wei và Reibe Đối với ELISA đồng pha cạnh tranh, phổ biến nhất là phương pháp của Rubenstein và cộng sự (1972), đã được thương mại hóa dưới tên EMIT (công ty Syva). Kháng nguyên cạnh tranh được gắn với enzyme sao cho liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ làm che lấp tâm hoạt động của enzyme, và 12 làm giảm hoạt tính. Khi có kháng nguyên mẫu, kháng thể sẽ phản ứng với kháng nguyên mẫu và tâm hoạt động enzyme sẽ được giải phóng tự do, tăng hoạt tính. Agc X + Ag Agc Ag Hình 5: Phương pháp của Rubenstein và cộng sự (1972) Phương pháp của Burd và cộng sự (1977) sử dụng kháng nguyên cạnh tranh gắn với cơ chất của enzyme. Việc liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ ngăn cản không cho cơ chất gắn vào enzyme. Kháng nguyên mẫu sẽ cạnh tranh kháng thể và giải phóng các cơ chất này. X + Ag Agc Agc Ag Hình 6: Phương pháp của Burd và cộng sự (1977) 13 Carrico và cộng sự (1976) đề xuất phương pháp gắn kháng nguyên cạnh tranh với cofactor hoặc inhibitor của enzyme. Tương tự như trên, việc liên kết với kháng thể sẽ ngăn cản cofactor hoặc inhibitor gắn với enzyme. Sự ngăn cản này sẽ giảm đi khi kháng nguyên mẫu giành lấy kháng thể, và sẽ làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzyme tùy theo chất liên kết là cofactor hay inhibitor. Cofactor X Agc + Ag Agc Ag Hình 7: Phương pháp của Carrico và cộng sự (1976) Một biến thể tương tự phương pháp của Carrico là phương pháp được đề xuất bởi Bacquet và Twumasi (1984), gắn kháng nguyên cạnh tranh với advidin. Lúc này advidin sẽ đóng vai trò tương tự như inhibitor trong phương pháp trên đối với các enzyme chứa biotin. X Biotin Avidin Agc X Agc + Ag Ag Hình 8: Phương pháp của Bacquet và Twumasi (1984) 14 5. Lựa chọn phương pháp ELISA thích hợp: Việc lựa chọn ELISA trong số rất nhiều kỹ thuật chẩn đoán cũng như việc lựa chọn phương pháp thích hợp nhất của ELISA để dùng vào một xét nghiệm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất là khả năng tìm được kháng thể đặc hiệu, thời gian thực hiện xét nghiệm, giới hạn phát hiện và yêu cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu. Nền tảng của kỹ thuật ELISA dựa trên liên kết miễn dịch đặc hiệu, do đó việc có được kháng thể đặc hiệu với một yếu tố là điều tiên quyết trong ELISA. Đây là nguyên nhân chính yếu và quan trọng nhất khiến ELISA hay một số phương pháp trong ELISA không thể sử dụng được trong một số trường hợp, ví dụ như phân biệt các subtype của một số vi khuẩn và virus. Thời gian thực hiện xét nghiệm cũng là yếu tố rất quan trọng trong thực tiễn. Mặc dù ELISA là kỹ thuật có thời gian thực hiện khá nhanh, tùy theo xét nghiệm có thể từ khoảng một tiếng cho đến vài ngày nếu sử dụng các bộ KIT ELISA chuẩn bị sẵn, tuy nhiên do yêu cầu thực tế, đôi khi thời gian xét nghiệm này vẫn chưa thích hợp, buộc người ta phải lựa chọn các kỹ thuật khác nhanh hơn dù tốn kém hơn. Giới hạn phát hiện của một phương pháp cho biết lượng yếu tố tối thiểu mà phương pháp có thể phát hiện được. Mặc dù đã có nhiều phương pháp giúp làm giảm giới hạn phát hiện, tuy nhiên về phương diện này ELISA vẫn còn kém khá xa so với các phương pháp dựa trên phân tử như sắc ký khối phổ, lai protein, lai nucleic acid, PCR… Độ nhạy và độ đặc hiệu của một phương pháp cũng phải được tính đến. Độ nhạy (sensitivity) cho biết tỉ lệ các mẫu thực sự dương trong số các mẫu được chẩn đoán là dương và ngược lại, độ đặc hiệu (specificity) cho biết tỉ lệ các mẫu thực sự âm trong số các mẫu được chẩn đoán là âm. Trên lý thuyết thống kê xác suất, việc tăng độ nhạy sẽ làm giảm độ đặc hiệu và ngược lại. Do đó tùy theo yêu cầu thực tế của xét nghiệm, cần xác định độ nhạy và độ đặc hiệu thích hợp nhất. Ví dụ như đối với xét nghiệm những vi sinh vật nguy hiểm, cần thiết phải tăng độ nhạy để không bỏ sót trường hợp dương tính nào. Cũng nên tính đến tỉ lệ dương tính trong số các mẫu. Ví dụ như đối với hai loại bệnh có mức độ nguy hiểm như nhau, tuy nhiên một loại bệnh có tỉ lệ mắc trong dân cư thấp, thì yêu cầu phải tăng độ đặc hiệu nhằm giảm số lượng những ca chẩn đoán nhầm. Sau khi xác định được độ nhạy và độ đặc hiệu cần thiết, việc lựa chọn một kỹ thuật hay một phương pháp có các thông số tương thích cũng là một vấn đề không dễ dàng. Độ nhạy và độ đặc hiệu của một kỹ thuật hay một phương pháp biến thiên tùy theo bản thân kỹ thuật hay phương pháp đó (ví dụ ELISA gián tiếp có độ nhạy cao hơn nhưng độ đặc hiệu kém hơn so với ELISA trực tiếp), khả năng đáp ứng của phương pháp đối với từng loại mẫu (ví dụ các mẫu nhiều chất tạp như huyết thanh sẽ làm giảm độ đặc hiệu của các phương pháp ELISA trực tiếp và gián tiếp do nhuộm màu nền cao), từng đặc tính của kháng thể và enzyme, từng điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ, pH, các thiết bị…). Người thực hiện xét nghiệm cần linh hoạt, lựa chọn và kết hợp các phương pháp khác nhau tùy theo điều kiện thực tế của mình để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cần thiết. Ngoài những yếu tố tiên quyết trên, cũng cần tính đến những yếu tố tùy chọn khác như mức độ phức tạp, độ an toàn, khả năng hệ thống hóa và chi phí cho một xét nghiệm. Về phương diện này, ELISA có ưu điểm là rất đa dạng về phương pháp, cho phép nhiều lựa chọn trong thực tiễn. 6. Kết luận: Mặc dù đã có sự xuất hiện của nhiều phương pháp mới, ELISA cho đến nay vẫn là một trong những kỹ thuật quan trọng nhất trong miễn dịch học và nhiều lĩnh vực khác, nhờ vào tính đơn giản, nhanh chóng, khá đặc hiệu và giá thành thấp. Chính vì vậy, ELISA đã không ngừng được cải tiến và nhiều phương pháp khác nhau tiếp tục ra đời nhằm hoàn thiện và tối ưu hóa kỹ thuật này trong từng trường hợp cụ thể. Qua những phương pháp và kỹ thuật tổng quát nhất được thảo luận trên đây, 15 chúng ta có thể thấy được phần nào sự đa dạng của kỹ thuật ELISA. Sự đa dạng này cho phép có nhiều lựa chọn hơn trong sử dụng ELISA, tuy nhiên nó cũng yêu cầu người thực hiện càng cần phải nắm rõ tất cả các biến thể này nhằm lựa chọn được phương pháp tối ưu nhất, đồng thời cũng cần có sự linh động cần thiết để kết hợp và thay đổi một cách hiệu quả để tạo ra một quy trình cụ thể cho từng thí nghiệm, từng xét nghiệm chẩn đoán. Nếu thực hiện được điều này, ELISA có thể trở thành một công cụ rất mạnh cả trong nghiên cứu lẫn trong thực tiễn. Tài liệu tham khảo: R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg, 1985, Laboratory Techniques In Biochemistry And Biology, volume 15, P. Tijssen, Practice And Theory Of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, Netherlands John M Walker, 2008, Methods In Molecular Biology, volume 516, John A. Crowther, The ELISA Guide Book, 2nd edition, Humana Press, Springer, New York, USA John M Walker, 1995, Methods In Molecular Biology, volume 42, John A. Crowther, ELISA: Theory And Practice, Humana Press, Springer, New York, USA IDEXX Laboratories, Inc., 2007, ELISA Technical Guide http://en.wikipedia.org http://www.docjax.com http://www.ncbi.nlm.ni.gov 16