Tài liệu Bước đầu khảo sát quá trình lên men và áp dụng kỹ thuật clea để thu nhận enzyme cellulase

Ketnooi.com ket noi cong dan dien tu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT CLEA ĐỂ THU NHẬN ENZYME CELLULASE CBHD: TS. HUỲNH NGỌC OANH SVTH: NGUYỄN BÁ HUY MSSV: 60600883 TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt những năm học vừa qua, đặc biệt trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học và cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức quí báu trong suốt thời gian em học tập và thực hiện khóa luận. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cô Huỳnh Ngọc Oanh đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn giáo viên phản biện đã giành thời gian quí báu của mình để đọc nội dung luận văn. Em xin chân thành cảm ơn ba mẹ và bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin gởi đến tất cả quý Thầy, Cô, gia đình và các bạn sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất. i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i MỤC LỤC ................................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................v DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii CHƯƠNG 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................1 1.2. Mục đích đề tài ................................................................................................1 1.3. Nội dung thực hiện ..........................................................................................1 CHƯƠNG 2 2.1. Enzyme cellulase ..........................................................................................3 2.1.1. Giới thiệu, phân loại, nguồn gốc .............................................................3 2.1.2. Cơ chất cellulose ......................................................................................4 2.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase.................................................................5 2.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................................7 2.2.1. Đặc điểm chung .......................................................................................7 2.2.2. Cellulase được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis ..................................8 2.3. Sản xuất enzyme nhờ VSV...........................................................................9 2.3.1. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật ........................... 10 2.3.2. Phương pháp lên men vi sinh vật thu nhận enzyme hòa tan .............. 12 2.3.3. Thiết bị lên men (Fermenter New Brunswick Co. Bioflo 110)............. 13 2.4. Enzyme cố định ........................................................................................... 16 2.4.1. Định nghĩa ............................................................................................. 16 2.4.2. Ưu điểm của enzyme cố định ............................................................... 16 2.4.3. Các phương pháp cố định enzyme ....................................................... 17 2.5. 2.5.1. Phương pháp tạo liên kết chéo ...................................................................17 Giới thiệu glutaraldehyde.....................................................................18 ii 2.5.2. 2.6. Phương pháp cross-linked enzyme aggregate (CLEA) ....................... 18 Một số ví dụ về cố định celluase .................................................................20 CHƯƠNG 3 ...............................................................................................................1 3.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 21 3.2. Một số phương pháp chung ........................................................................ 22 3.2.1. Phưong pháp xác định hàm lượng protein ........................................... 22 3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase ............................................ 22 3.2.3. Phương pháp tính toán.......................................................................... 23 3.3. Cách tiến hành thí nghiệm ......................................................................... 24 3.3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................................25 3.3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp ........ 26 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp ............... 30 3.4. Khảo sát quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA.............. 31 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất ........ 31 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định............. 32 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cố định đến hiệu suất cố định .............. 33 CHƯƠNG 4 4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .......................................35 4.1.1. Quan sát vi sinh vật .............................................................................. 35 4.1.2 Định tính khả năng sinh tổng hợp cellulase của Bacillus subtilis .......36 4.1.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis ...................... 37 4.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp.............. 38 4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 38 4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng CMC đến khả năng .......39 4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp cellulase .......... 40 4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase .41 4.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase .....42 iii 4.4. Khảo sát quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA ............... 43 4.4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định ............ 43 4.4.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến sự cố định Cellusoft ........ 45 4.4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft ............ 46 4.5. Khảo sát khả năng tái sử dụng của Cellusoft cố định dạng CLEA ........... 48 CHƯƠNG 5 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 50 5.2. Kiến nghị ......................................................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 52 PHỤ LỤC................................................................................................................. 52 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CLEA : Cross-linked enzyme aggregate CMC : Carboxymetyl-cellulose glu : Glutaraldehyde E : Enzyme HL : Hàm lượng HS : Hiệu suất HĐ : Hoạt độ cđ : Cố định dd : Dung dịch bđ : Ban đầu cl : Còn lại UI : Đơn vị hoạt độ (của enzyme) ∑ : Tổng số v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cellulase hoạt động trên bề mặt cellulose ................................................3 Hình 2.2. Ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose ..................................................4 Hình 2.3. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose ...............................................4 Hình 2.4. Cấu trúc vi sợi ..........................................................................................5 Hình 2.5. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson .................................................5 Hình 2.7. Trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cellulase .....................................8 Hình 2.8. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzyme ........9 Hình 2.9. Cơ chế điều hòa trấn áp sinh tổng hợp enzyme bởi sản phẩm .............. 10 Hình 2.10. Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme ................................ 11 Hình 2.11. Một số thiết bị lên men của New Brunswick Co. .................................13 Hình 2.12. Hệ thống Fermenter Bioflo 110 (New Brunswich Co., Inc., NJ, Mỹ)..15 Hình 2.13. Thiết kế headplate ................................................................................. 15 Hình 2.14. Sơ đồ phân loại các phương pháp cố định enzyme .............................. 17 Hình 2.15. Cấu tạo hóa học của glutaraldehyde .................................................... 18 Hình 2.16. Mô hình 3D của phân tử glutaraldehyde ............................................ 18 Hình 2.17. Phương pháp CLEA.............................................................................. 19 Hình 2.19. Phản ứng giữa poly(glutaraldehyde) với amin của protein ............... 19 Hình 2.18. Phản ứng polyme hóa glutaraldehyde ................................................. 19 Hình 3.1. Sơ đồ các bước nghiên cứu chung .......................................................... 24 Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp ..26 Hình 3.4. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả năng ......... 27 Hình 3.5. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH lên men đến khả năng tổng hợp ........... 28 Hình 3.6. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp ...29 Hình 3.7 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase ..30 Hình 3.8. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất........ 31 Hình 3.9 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất cố định enzyme.......32 vi Hình 3.10. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định enzyme .....33 Hình 3.11. Sơ đồ khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA ..34 Hình 4.1. Nhuộm Gram Bacillus subtilis và quan sát dưới kính hiển vi (x100)....35 Hình 4.2. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis sau hai ngày cấy trãi.................... 35 Hình 4.3. Vòng thủy phân biểu hiện hoạt tính cellulase ........................................ 36 Hình 4.4. Kết quả điện di ........................................................................................ 36 Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis theo ........... 37 Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng ............... 38 Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp .....39 Hình 4.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp 40 Hình 4.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp .41 Hình 4.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng ............. 42 Hình 4.11. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng tổng …42 Hình 4.12. Khảo sát nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định Cellusoft ................ 43 Hinh 4.13. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định..44 Hình 4.14. Khảo sát thời gian cố định Celusoft...................................................... 45 Hình 4.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định ..45 Hình 4.16. Khảo sát nhiệt độ cố định Cellusoft...................................................... 46 Hình 4.17. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft 47 Hình 4.18. Đồ thị biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng ........... 48 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc cellulase từ Bacillus subtilis ........................................8 Bảng 2.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ Bacillus subtilis ......................................8 Bảng 4.1. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp .......... 38 Bảng 4.2. Biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp cellulase 40 Bảng 4.3. Biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp .......... 41 Bảng 4.4. Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp............ 41 Bảng 4.5. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp ......... 42 Bảng 4.6. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất cố định ....44 Bảng 4.7. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định .............. 45 Bảng 4.8. Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định............................. 46 Bảng 4.9. Biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA............ 48 viii CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Công nghệ sản xuất enzyme ở Việt Nam còn đang ở giai đoạn nghiên cứu, đa số phải nhập từ nước ngoài về. Trong khi các ứng dụng có liên quan đến enzyme thì ngày càng tăng và hiệu quả ngày càng cao. Trong số các enzyme thông dụng có cellulase - hệ enzyme thủy phân cellulose – là một enzyme có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, môi trường, công nghiệp dệt, tẩy …. Việc nghiên cứu các quá trình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam là cần thiết. Đối tượng được sử dụng để sản xuất enzyme với qui mô công nghiệp đều là vi sinh vật. Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872. Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Cùng với Bacillus subtilis, hệ enzyme cellulase đã được nghiên cứu. Cross-linked enzyme aggregate, một phương pháp cố định enzyme mới, một phương pháp cố định không sử dụng chất mang, một phương pháp đang được thế giới quan tâm, một phương pháp được xem là góp phần cho cuộc cách mạng công nghệ xanh. Phương pháp đã được áp dụng thành công trên rất nhiều loại enzyme và giờ đây sẽ là những khảo sát ban đầu trên enzyme cellulase. Cơ giới hóa, tự động hóa đi chung với nhiều phát minh và máy móc hiện đại, từ đó các hệ thống lên men fermenter với khả năng hữu ích lần lượt ra đời. Việc áp dụng những thiết bị công nghệ cao cũng là một phần thiết yếu giúp nâng cao hiệu năng và hiệu suất của quá trình sản xuất enzyme. Việc áp dụng những kỹ thuật và thiết bị lên men hiện đại, những phương thức cố định enzyme tiên tiến để sản xuất chế phẩm enzyme hữu ích, đa dụng là hướng đi của đề tài chúng tôi. 1.2. Mục đích đề tài  Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp để lên men chủng Bacillus subtilis thu nhận chế phẩm cellulase đạt hiệu suất cao.  Khảo sát điều kiện cố định thích hợp cho phương pháp cross-linked enzyme aggregate để cố định chế phẩm Cellusoft đạt hiệu suất cao. 1.3. Nội dung thực hiện  Xác định một số đặc tính sinh học của Bacillus subtilis.  Xác định hoạt tính cellulase của dịch sau nuôi cấy. 1 Mở đầu  Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của chủng Bacillus subtilis ở điều kiện erlen.  Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến sinh tổng hợp cellulase của chủng Bacillus subtilis ở quy mô fermenter.  Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp cross-linked enzyme aggregate.  Khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA. 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan tài liệu 2.1. Enzyme cellulase 2.1.1. Giới thiệu, phân loại, nguồn gốc Cellulase là một phức hợp gồm nhiều enzyme. Các loại enzyme trong phức hợp này sẽ lần lượt phân hủy cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Theo Wood và McCrae (1979), quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi ba nhóm enzyme: exoglucanase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiase (EC 3.2.1.21). Exoglucanase còn gọi là 1,4 β-glucan cellubiohydrolase, enzyme này thủy phân cellobiose từ đầu không khử của chuỗi glucan và cellodextrin. Endoglucanase còn gọi là 1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase, enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose trong lignin và β-D glucan tạo ra sản phẩm là cellodextrin, cellobiose và glucose. Cellobiase còn gọi là β-D glucoside glucohydrolase hay β-glucosidase, enzyme này tham gia phân hủy cellobiose và cellodextrin đến cellohexose và cuối cùng thành glucose. Các enzyme cellulase đã xuất hiện trên thị trường từ vài thập kỹ và được thu nhận từ các nguồn khác nhau. Ở động vật cellulase được tìm thấy trong dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm… Ở thực vật cellulase có trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen… Còn ở vi sinh vật cellulase được sản sinh ra bởi các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase chủ yếu từ vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng như nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…; xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…; vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis… Hình 2.1. Cellulase hoạt động trên bề mặt cellulose [32] 3 Tổng quan tài liệu 2.1.2. Cơ chất cellulose Cellulose là hợp chất cao phân tử, chúng là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, trong gỗ lá kim cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích. Ngoài ra còn có ở tế bào một số loài vi sinh vật nhưng không có trong tế bào động vật. Hình 2.2. Ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose [31] Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, chúng do các mắt xích β-D-Glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside (các liên kết này thường không bền trong các phản ứng thủy phân). Cellulose chứa các glucose không phân nhánh và thường lệch một góc 180o và có dạng như một chiếc ghế bành. Hình 2.3. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose [31] Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro. Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3 nm và các sợi sơ cấp này kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất và thường tồn tại hai vùng:  Vùng kết tinh: cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài. Ở vùng này enzyme cellulase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi.  Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. 4 Tổng quan tài liệu Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc thì ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình. Hình 2.4. Cấu trúc vi sợi [30] 2.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả. Hình 2.5. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson [2] 5 Tổng quan tài liệu 2.1.4. Một số ứng dụng phổ biến của cellulase Cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường. Dù được biết đến chậm hơn rất nhiều so với enzyme amylase và protease, nhưng những nghiên cứu và ứng dụng của cellulase là không ít. Cellulase được ứng dụng để cải thiện gía trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đường hóa các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol. Trong công nghệ sản xuất bột giấy: trong giai đoạn nghiền cần bổ sung endoβ-1,4-glucanase để làm tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Việc bổ sung endoglucanase và hỗn hợp các hemicellulase, pectinase trước khi nghiền hóa học làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm: trong sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả. Bổ sung endoglucanase để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả. Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm có chứa một phần polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt trong ruột. Vì thế, việc bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong đường tiêu hóa động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân. Tuy nhiên, việc bổ sung một số enzyme như cellulase, hemicelluase sẽ phá hủy tế bào, giúp tăng lượng đường tạo thành và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu sẽ tăng. Trong lên men tế bào và tái tổ hợp gen: sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần, có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen: dung hợp tế bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố mẹ. 6 Tổng quan tài liệu 2.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis Có rất nhiều VSV có khả năng sinh tổng hợp ra enzyme cellulase. Trong số đó có cả vi khuẩn Bacillus subtilis, hệ enzyme của chúng rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase... Vì vậy Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase,.... Những nghiên cứu gần đây cho thấy tiềm năng sản xuất ra enzyme cellulase của Bacillus subtilis là rất lớn [6]. 2.2.1. Đặc điểm chung Vi khuẩn Bacillus subtilis phân bố phổ biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khô nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ khô. Là những vi khuẩn gram dương, hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3-5) × 0,6 µm, nhiều khi tế bào nối với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch. Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 3050oC, thường lên men ở 37oC. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6-0,9 µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200-300 năm. Vi khuẩn Bacillus subtilis có màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu đựng được điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày không màu, trong suốt còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen. Hình 2.6. Vi khuẩn Bacillus subtilis [29] 7 Tổng quan tài liệu 2.2.2. Cellulase được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc cellulase từ Bacillus subtilis [24] Tên protein Tên thường dùng: Endoglucanase. EC=3.2.1.4 Các tên khác:  Carboxymethyl-cellulase  Short name=CMCase=Cellulase  Endo-1,4-beta-glucanase Gen mã hóa Tên: eglS (bglC, gld) Ordered Locus Names: BSU18130 Sinh vật Bacillus subtilis Phân loại dòng Bacteria › Firmicutes › Bacillales › Bacillaceae › Bacillus Bảng 2.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ Bacillus subtilis [24] Chiều dài chuỗi 499 AA. Tình trạng trình tự Hoàn chỉnh. Trọng lượng phân tử 55 287 Da Sự tồn tại Tồn tại ở dạng protein Hình 2.7. Trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cellulase của Bacillus subtilis [24] 8 Tổng quan tài liệu 2.3. Sản xuất enzyme nhờ VSV Mãi đến thế kỷ 18 người ta mới biết về sự tồn tại của VSV trong thế giới sinh vật, tuy nhiên việc ứng dụng các công nghệ có hoạt động của VSV thì có từ rất lâu đời. Trong đó công nghệ enzyme từ VSV phát triển rất mạnh, đặc biệt ở thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21. Nguồn enzyme này dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý VSV và về kỹ thuật sản xuất. Những ưu điểm đó được tóm tắt như sau: tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh. Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao. VSV là giới rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công nghiệp. Nguồn nguyên liệu dùng cho sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm. VSV có thể sinh tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Vi sinh vật giống Nhân giống Sản xuất chế phẩm enzyme Lên men bề mặt Sản xuất VSV cố định Lên men chìm Thu nhận chế phẩm enzyme thô Ứng dụng lên men Ứng dụng Tinh sạch enzyme Thu nhận enzyme tinh khiết Sản xuất enzyme không hòa tan Ứng dụng Ứng dụng Hình 2.8. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzyme [2] 9