Tài liệu Báo cáo tổng kết cpvs

Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPVS CPSH Đ/C TLB CSB MTSX DH DR Chế phẩm vi sinh Chế phẩm sinh học Đối chứng Tỷ lệ bệnh Chỉ số bệnh Môi trường sản xuất Diện hẹp Diện rộng Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 1 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Thành phần chính của một số nguyện liệu chứa chitin Bảng 2: Hàm lượng chitin, protein và canxi (% wt) của vỏ tôm các vùng Bảng 3. Tên và địa điểm lấy mẫu đất trồng tiêu và rễ tiêu tại Quảng Trị Bảng 4. Trình tự và thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR cho vi khuẩn Bảng 5. Trình tự và thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR cho xạ khuẩn Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR cho xạ khuẩn Bảng 8. Diện tích và sản lượng hồ tiêu Quảng Trị qua các năm Bảng 9. Ký hiệu chủng và mẫu phân lập Bảng 10. Hình thái của các chủng phân lập Bảng 11. Kết quả định danh các chủng nấm phân lập Bảng 12. Hình thái tế bào của các chủng đối kháng Bảng 13. Khả năng kháng một số nguồn bệnh của các chủng vi khuẩn Bảng 14. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nghiên cứu Bảng 15. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nghiên cứu khi nuôi cấy trên môi trường ISP4 Bảng 16. Khả năng kháng nấm kiểm định của các chủng xạ khuẩn Bảng 17. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng XK28 và XK3 Bảng 18. Khả năng sinh trưởng của 2 chủng XK28 và XK3 ở nhiệt độ khác nhau Bảng 19. Khả năng chịu muối của 2 chủng XK28 và XK3 Bảng 20. Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh của các chủng nấm phân lập Bảng 21. Mức độ đối kháng nguồn bệnh của các chủng nấm phân lập Bảng 22. Kết quả xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ ADN (µg/ml) của các chủng nghiên cứu Bảng 23. Kết quả xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ ADN (µg/ml) của các chủng nghiên cứu Bảng 24. Công thức môi trường thử nghiệm Bảng 25. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên mật độ vi khuẩn Bảng 26. Công thức môi trường thử nghiệm Bảng 27. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên mật độ xạ khuẩn Bảng 28. Công thức môi trường thử nghiệm Bảng 29. Trọng lượng tế bào khô sau các khoảng thời gian lên men Bảng 30. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ của B. subtilis Bảng 31. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ của B. flexus Bảng 32. Mật độ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu dưới các pH môi trường ban đầu khác nhau (CFU/ml) Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 2 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 Bảng 33. Mật độ của các chủng vi khuẩn tuyển chọn theo lưu lượng khí(CFU/ml) Bảng 34. Tổng hợp các thông số công nghệ cho quá trình lên men chìm thu hồi sinh khối 2 chúng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm Bảng 35. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh khối củavi nấm Penicilium oxalicum (g/l) Bảng 36. Sinh khối của chủng vi nấm nghiên cứu dưới các pH môi trường ban đầu khác nhau (g/l) Bảng 37. Mật độ của chủng vi nấm Penicilium oxalicum theo lưu lượng khí Bảng 38. Tổng hợp các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình lên men của chủng Penicilium oxalicum sử dụng cho quá trình sản xuất chế phẩm. Bảng 39. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ của xạ khuẩn S.diastatochromogenes Bảng 40. Mật độ của chủng xạ khuẩn nghiên cứu dưới các pH môi trường ban đầu khác nhau (CFU/ml) Bảng 41. Mật độ của chủng xạ khuẩn S.diastatochromogenes theo lưu lượng khí Bảng 42. Các điều kiện công nghệ tối ưu cho quá trình lên men của chủng xạ khuẩn S.diastatochromogenes Bảng 43. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ của vi khuẩn(CFU/g) Bảng 44. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ của vi nấm (CFU/g) Bảng 45. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ xạ khuẩn (CFU/g) Bảng 46. Mật độ của các chủng vi sinh vật theo lưu lượng khí (CFU/g) Bảng 47. Mật độ của các chủng vi sinh vật theo lưu lượng khí (CFU/g) Bảng 48. Ảnh hưởng của độ ẩm lên mật độ vi sinh vật (CFU/g) Bảng 49. Ảnh hưởng của độ ẩm lên mật độ vi sinh vật (CFU/g) Bảng 50. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất lên sinh khối của 2 chủng vi khuẩn Bảng 51. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất lên sinh khối của vi nấm Penicilium oxalicum và xạ khuẩn S.diastatochromogenes Bảng 52. Đánh giá thành phần cơ chất lên mật độ các chủng vi sinh vật Bảng 53. Hàm lượng -chitin trong mai mực ống Bảng 54. Độ chuyển dịch hoá học của proton (1H) của chitosan Bảng 55. Kết quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan tại các nồng độ khác nhau Bảng 56. Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ axít khác nhau Bảng 57. Kết quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở nhiệt độ khác nhau Bảng 58. Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ axít khác nhau Bảng 59. Kết quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở nhiệt độ khác nhau Bảng 60. Độ chuyển dịch hoá học của proton (1H) của chitosan Bảng 61. Độ chuyển dịch hoá học của cacbon (13C) của Chitosan Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 3 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 Bảng 62. Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ axít khác nhau Bảng 63. Kết quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở nhiệt độ khác nhau Bảng 64. Độ chuyển dịch hóa học của proton (1H) của Chitosan Bảng 65. Độ chuyển dịch hóa học của cacbon ( 13C) của Chitosan Bảng 66. Độ dịch chuyển của các tín hiệu trên phổ 1H-NMR của chitosan khối lượng phân tử 5-20KDa Bảng 67. Ảnh hưởng của các công thức xử lý ở diện hẹp và diện rộng đến TLB (%) và CSB (%) vàng lá tiêu tại huyện Cam Lộ - tỉnh Quảng Trị năm 2013 Bảng 68. Ảnh hưởng của các công thức xử lý ở diện rộng đến TLB (%) và CSB (%) vàng lá tiêu tại huyện Gio Linh - tỉnh Quảng Trị năm 2013 Bảng 69. Ảnh hưởng của các công thức xử lý ở diện rộng đến TLB (%) và CSB (%) vàng lá tiêu tại huyện Vĩnh Linh - tỉnh Quảng Trị năm 2013 Bảng 70. Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh và chế phẩm sinh học Chitosan đến năng suất hồ tiêu tại Quảng Trị năm 2013. Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 4 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ1. Thuỷ phân chitosan bằng axít HCl Sơ đồ 2. Phản ứng tổng hợp chitooligome Sơ đồ 3. Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng phù hợp cho cây tiêu Sơ đồ 4. Cơ chế phản ứng của thủy phân axít liên kết glycosid của Chitosan (phản ứng SN1) Sơ đồồ 5. Cơ chếế phản ứng thủy phân liến kếết N-acetyl (phản ứng SN2) Sơ đồ 6. Quy trình điều chế chất kích thích sinh trưởng từ chitosan khối lượng phân tử 20÷50KDa Sơ đồ 7. Quy trình chế tạo chế phẩm sinh học từ chitosan khối lượng phân tử 5 20 KDa Sơ đồ 8. Quy trình chế tạo chế phẩm sinh học từ chitosan sử dụng trên cây Tiêu Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 5 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 MỤC LỤC Trang Phần 1. Mở đầu……………………………………………………………...............12 Phần 2. Tổng quan…………………………………………………………………..14 2.1.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước……………………………………....14 2.1.1.Tình hình nghiên cứu trong nước…………………………………………........14 2.1.2.Tình hình nghiên cứu ngoài nước…………………………………………...….15 2.2. Một số bệnh hại chính trên cây tiêu do vi sinh vật………………………….….17 2.2.1.Bệnh chết nhanh…...……………………………………………………….…..17 2.2.2. Bênh chết chậm (vàng lá, thối rễ) ………………………………………..…...18 2.3 Kỹ thuật quan sát các đặc điểm hình thái của nấm trên môi trường nuôi cấ………..…… 19 2.4. Các chủng vi sinh đối kháng phù hợp cho cây tiêu tại Quảng Trị………..…....19 2.5. Giới thiệu chung về chitin/chitosan………………………………………..……21 2.5.1.Cấu trúc………………………………………………………………………...21 2.5.2. Độ kết tinh……………………………………………………………….…….23 2.5.3. Khối lượng phân tử trung bình của chitin/chitosan………………… ………..23 2.5.4. Tính tan……………………………………………………………………..….24 2.5.5. Phương pháp nghiên cứu để điều chế chitin/chitosan……………………..….25 2.5.6. Hàm lượng và một số ứng dụng của chitin/chitosan………………………….30 Phần III. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………..…….34 3.1. Cách tiếp cận……………………………………………………………….....….34 3.2. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng………………………………..…….34 3.2.1.Phương pháp nghiên cứu tập quán canh tác hồ tiêu của địa phương……..........34 3.2.2.Phương pháp phân lập tìm tác nhân gây hại……………………………………….....35 3.2.2.1.Vật liệu và đối tượng nghiên cứu……………………………………………….….35 3.2.2.2.Phương pháp…………………………………………………………………...37 3.2.3. Phương pháp nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với nấm bệnh trên tiêu khu vực Quảng Trị..................................................38 3.2.3.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………….……………….....38 3.2.3.2.Vật liệu…………………………………………………...…………………...39 3.2.3.3. Hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy. ……….…………………………39 3.2.3.4 Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………….39 3.2.4.Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình lên kháng phù hợp cho cây tiêu…………………………………………………………………….…......44 3.2.4.1.Nguyên liệu……………………………………………………...…………....44 3.2.4.2.Phương pháp………………………………………………………….……….44 Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 6 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 3.2.5. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ Chitosan và dẫn xuất…………………………………..……....44 3.2.5.1.Điều chế Chitin………………………………………………..………..……..44 3.2.5.2. Điều chế Chitosan………………………………………………….…………45 3.2.5.3. Xác định độ axetyl hoá ……………………………….………………..…….45 3.2.5.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình số của chitosan……………………46 3.2.5.5. Thiết bị nghiên cứu...........................................................................................47 3.2.6. Phương pháp nghiên cứu xây dựng mô hình sử dụng chế phẩm vi sinh và chitosan kết hợp thâm canh cho cây tiêu. ………………………………….…...…48 3.2.6.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………..……..……..48 3.2.6.2. Địa điểm …………………………………………………..……………........48 3.2.6.3. Vật liệu…………………………………………………..………………..….48 3.2.6.4.Nội dung………………………………………………..……………….…….49 3.2.6.5. Phương pháp……………………………………………….……………..….49 Phần IV.Nội dung và kết quả đạt được……………………….……………………51 A.Nghiên cứu cơ bản………………………………………………………………..51 4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu tập quán canh tác của địa phương tìm ra các nguyên nhân dẫn đến năng suất thấp của cây tiêu. ………………………..….....51 4.1.1. Diện tích và sản lượng hồ tiêu Quảng Trị. …………………………….....…....51 4.1.2. Tập quán canh tác của địa phương……………………………...………...……52 4.1.3.Kết luận………………………………………………...…………………....….56 4.2. Nội dung 2: Phân lập tìm tác nhân gây hại trên cây tiêu Quảng Trị………..........57 4.2.1. Phân lập và làm sạch………………………………………………...……....…57 4.2.2. Định danh các chủng vi nấm phân lập………………………………….….......62 4.2.3.Kết luận…………………………………………...………………………….....69 4.3. Nội dung 3: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với tác nhân gây bệnh rễ của cây tiêu ở khu vực Quảng trị…………………….…….….70 4.3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nghiên cứu………………………………..….70 4.3.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn……………………………………….……70 4.3. 1.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn…………………………………….……..74 4.3. 1.3. Phân lập và tuyển chọn nấm………………………………………….……..77 4.3.2. Kết quả định danh vi khuẩn bằng kít API. ……………………………………79 4.3.3. Tách dòng và giải trình tự 16s ARN của 4 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu………………………………..................................80 4.3.3.1. Tách dòng và giải trình tự 16S ARN của 4 chủng vi khuẩn...........................80 4.3.3.2. Tách dòng và giải trình tự 16S ARN của 2 chủng xạ khuẩn.........................85 4.3.3.3.Kết luận……………………………………………………..……….………87 Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 7 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 B.Xây dựng quy trình, mô hình…………………………………………………...88 4.4. Nội dung 4: Xây dựng quy trình lên men sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng phù hợp cho cây tiêu……………………………………..….…..88 4.4.1.Lựa chọn môi trường lên men phù hợp với các chủng nghiên cứu……..……88 4.4.1.1.Nguyên liệu và phương pháp..………………………………………..….….88 4.4.1.2. Lựa chọn môi trường thích hợp cho lên men chìm…………………...……89 4.4.1.3. Kết luận……………………………………………………………..………92 4.4.2.Thiết lập giá trị thông số kỹ thuật tối ưu của quá trình lên men chìm…...…..92 4.4.2.1. Nguyên liệu và phương pháp…………………………………………….…92 4.4.2.2. Lựa chọn điều kiện tối ưu……………………………………………..……93 4.4.2.3. Kết luận………………………………………………………………..……99 4.4.3.Tối ưu các thông số kỹ thuật lên men bề mặt thu nhận chế phẩm dạng bột………………………………………………………….…..……99 4.4.3.1.Nguyên liệu và phương pháp……………………………………….…...…...99 4.4.3.2.Xác định các điều kiện lên men…………………………………….…...….100 4.4.3.3. Kết luận……………………………………………………………...……..103 4.4.4. Nghiên cứu lựa chọn cơ chất lên men bề mặt phù hợp với các chủng nghiên cứu…………………………………………………………….…..…103 4.4.4.1. Nguyên liệu và phương pháp…………………………………………...….103 4.4.4.2. Lựa chọn cơ chất lên men bề mặt phù hợp với các chủng nghiên cứu...…104 4.4.4.3.Kết luận………………………………………………………………..…....106 4.4.5. Quy trình lên men sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng phù hợp cho cây tiêu......………………………………………………………………...……106 4.4.5.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men phù hợp với các chủng nghiên cứu……………………………………………………………………106 4.4.5.2. Thiết lập giá trị thông số kỷ thuật tối ưu của quá trình lên men chìm….…106 4.4.5.3. Tối ưu các thông số kỷ thuật lên men bề mặt thu nhận chế phẩm dạng bột…………………………………………………………..………107 4.4.5.4. Nghiên cứu lựa chọn cơ chất lên men bề mặt phù hợp với các chủng nghiên cứu………………………………………………………….........107 4.5. Nội dung 5: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ chitosa…......110 4.5. 1.Chế tạo chitosan khối lượng phân tử 20÷50KDa: khảo sát điều kiện phản ứng và tính chất của sản phẩm…………………………………......110 4.5.1.1.Khảo sát điều kiện phản ứng và tính chất của sản phẩm………………......110 4.5.1.2 Điều chế chitosan khối lượng phân tử 20-50 Kd ………………….……...114 4.5.2. Chế tạo chitosan khối lượng phân tử 5÷20 KDa…………………………....115 4.5.3.Chế tạo chitosan có khối lượng phân tử < 5KDa…………………….…...….118 Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 8 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 4.5.4. Chế tạo chế phẩm sinh học từ chitosan khối lượng phân tử 20-50 kDa…....122 4.5.5. Chế tạo chế phẩm sinh học từ chitosan khối lượng phân tử 520 KDa….....124 4.5.6. Chế tạo chế phẩm sinh học từ chitosan khối lượng phân tử < 5KDa…….....125 4.5.7. Quy trình chế tạo chế phẩm sinh học từ chitosan……………………….......127 4.5.8. Kết luận………………………………………………………………………128 4.6. Nội dung 6: Xây dựng mô hình sử dụng chế phẩm vi sinh và chitosan kết hợp thâm canh cho cây hồ tiêu……………………………………...………..…129 4.6.1.Vật liệu………………………………………………………………………...129 4.6.2.Phương pháp…………………………………………………………………...129 4.6.3. Kết quả………………………………………………………………………...130 4.6.3.1.Ảnh hưởng của các loại chế phẩm đến TLB và CSB vàng lá thối rễ cây hồ tiêu tại các địa điểm khảo nghiệm của tỉnh Quảng Trị năm 2013…………..130 4.6.3.2.Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh và chế phẩm sinh học Chitosan đến năng suất hồ tiêu tại Quảng Trị năm 2013…………………………………………..134 4.6.4.Kết luận…………………………………………………………..……...…….135 C.Đào tạo……………………………………………………..………………….….135 ĐÁNH GIÁ SO SÁNH CÔNG VIỆC ĐÃ THỰC HIỆN VỚI NỘI DUNG ĐĂNG KÝ…………………………………………………….…..136 Kết luận……………………………………………….……..…………………...…140 Phụ lục…………………………………………………………................................143 Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 9 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 PHẦN I. MỞ ĐẦU Hồ tiêu là một trong 10 mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam trong những năm qua, mang lại giá trị kinh tế và nguồn thu nhập lớn cho bà con nông dân. Đây là cây truyền thống và cũng là cây công nghiệp mũi nhọn của tỉnh Quảng Trị. Tổng diện tích đất thích nghi cho phát triển cây hồ tiêu của Quảng Trị là hơn 46 ngàn ha trong đó có gần 2500 ha đã được trồng và khai thác. Theo định hướng đến năm 2015, diện tích cây hồ tiêu trên địa bàn phát triển đạt hơn 3.000 ha, tập trung trên 4 huyện Vĩnh Linh, Gio Linh, Cam Lộ và Hướng Hóa. Chất lượng tiêu Quảng Trị được coi là tốt nhất so với các vùng khác trong cả nước. Cây hồ tiêu đã trở thành cây trồng quan trọng số một của người dân nơi đây. Tuy nhiên, năng suất hồ tiêu bình quân của tỉnh Quảng Trị còn thấp khoảng 11,5 tạ/ha, [6]. Có nơi rất thấp chỉ từ 3 – 4 tạ/ha; nơi cao nhất đạt được khoảng 30 tạ/ha. Trong khi đó, Tây Nguyên là khu vực có năng suất hồ tiêu bình quân cao nhất nước với 31,3 tạ/ha; trong đó tại tỉnh Gia Lai, năng suất đạt 45,2 tạ/ha. Nhìn chung, những địa phương và hộ trồng tiêu ở Việt Nam đạt hiệu quả kinh tế cao, phần lớn tập trung ở những nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi, có sự đầu tư và ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất thâm canh. Nguyên nhân năng suất và sản lượng cây hồ tiêu ở Quảng Trị thấp hơn bình quân chung của cả nước là do nhiều yếu tố tác động khác nhau: tập quán canh tác còn nhiều hạn chế, có những vườn hồ tiêu không được đầu tư chăm sóc sau thu hoạch, điều kiện tự nhiên không thuận lợi như những vùng trồng tiêu khác ở trong nước, chế độ phân bón chưa thích hợp, hệ thống tưới tiêu chưa được đầu tư cao, đặc biệt là do nhiều loại dịch bệnh gây ra làm tiêu chết hàng loạt như vàng lá thối cổ rễ do sự tấn công kết hợp giữa tuyến trùng, nấm F. oxysporium và một số loại nấm gây hại trong đất khác. Phổ biến nhất hiện nay là bệnh chết nhanh (CN) do Phytophthora capsici gây nên [3], [21]. Theo dự báo của Chi cục BVTV tỉnh Quảng Trị, trong thời gian tới các bệnh tuyến trùng, vàng lá thối gốc rễ, chết nhanh, thán thư lá… trên cây hồ tiêu sẽ tiếp tục phát triển và gây hại nặng trên những vườn đang bị bệnh, vùng ổ dịch. Nếu không sử dụng quy trình canh tác hợp lý, không có biện pháp phòng, trừ bệnh sớm và triệt để thì diện tích tiêu chết tiếp tục tăng. Hiện nay, biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến và xem như hữu hiệu nhất trong phòng trừ bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp trong đó có thuốc trừ nấm ngày càng nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và làm giảm chất lượng sản phẩm khi dư lượng thuốc cao, chi phí phòng trị bệnh cao. Ngoài ra, đất đai bạc màu, làm chết các sinh vật có ích, làm tăng khả năng kháng thuốc của sinh vật gây hại, kết quả là việc sản xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khăn. Đặc biệt là khu vực Miền Trung cây tiêu và cây cà phê thường bị thối cổ rễ do Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 10 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 Fusarium oxysporum, F. solani , Phytophthora và một số tác nhân khác [1],[2],[3],[4], [15] Để góp phần khắc phục tồn tại này, các nhà khoa học đang chú ý đến nguồn tài nguyên lớn thứ ba của giới tự nhiên – Tài nguyên vi sinh vật có ích để bảo vệ môi trường sinh thái. Phương pháp sử dụng vi sinh vật trong bảo vệ môi trường không những mang lại hiệu quả cao, an toàn, sản phẩm thu hoạch không ảnh hưởng tới người sử dụng, có lợi cho cân bằng sinh thái, mà còn giảm phần lớn lượng thuốc hoá học sử dụng. Quảng Trị nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với đặc trưng khí hậu nóng ẩm, lượng mưa hàng năm lớn, là điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật, mà điển hình là nấm bùng phát, gây hại cho cây trồng, dẫn đến tổn thất lớn cho sản xuất nông nghiệp. Mỗi năm chi phí trong việc phòng, trừ bệnh cây là rất cao, mà phần lớn là sử dụng thuốc hoá học. Trên thực tế, phương pháp này có hiệu quả tức thời nhưng nếu sử dụng lâu dài sẽ dẫn đến tình trạng thoái hoá đất và kháng thuốc của các nguồn bệnh. Vì vậy, biện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng sẽ là một trong những giải pháp thiết thực để có một nền sản xuất nông nghiệp bền vững [3]. Vì vậy cần phải có quy trình công nghệ sử dụng các chế phẩm vi sinh, chế phẩm sinh học Chitosan mà Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đang nghiên cứu nhằm tăng cường khả năng phòng chống bệnh, cải thiện môi trường, tăng năng xuất cây Hồ tiêu. Với nhiệm vụ: “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng một số chế phẩm sinh học nhằm nâng cao năng suất cây hồ tiêu ở Quảng Trị.” nhằm tăng năng suất, tạo ra sản phẩm sạch, an toàn, có chất lượng đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu, qua đó góp phần phát triển kinh tế xã hội một cách bền vững. Việc tiến hành nghiên cứu tập quán canh tác của địa phương tìm ra các nguyên nhân dẫn đến năng suất thấp của cây tiêu ở Quảng Trị, từ đó xây dựng quy trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh và chế phẩm chitosan thích hợp nhằm làm giảm tỷ lệ bệnh trên cây hồ tiêu, tăng năng suất hồ tiêu cũng như làm cơ sở để xây dựng và chuyển giao được quy trình công nghệ sử dụng chế phẩm sinh học trên cây hồ tiêu cho địa phương. Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 11 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 PHẦN II. TỔNG QUAN 2.1.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước. 2.1.1.Tình hình nghiên cứu trong nước Vi sinh vật có mặt trong hệ sinh thái thực vật giúp giảm khả năng bị bệnh và tác hại của bệnh, nhưng chỉ khi chúng phát triển mạnh. Vi sinh vật không có mặt tự nhiên trong môi trường thực vật có thể đưa từ ngoài vào để kiểm soát nguồn bệnh. Có hơn 1.600 loài vi khuẩn có ích, chúng giữ vai trò quan trọng trong cải tạo đất và trong đời sống của cây trồng. Chúng phân giải chất hữu cơ làm thức ăn cho cây trồng, làm tăng độ mùn xốp, tăng khả năng giữ nước cho đất, nhờ đó cây hấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn, giảm tác hại của ký sinh gây bệnh, bảo vệ cây trồng. Một số vi khuẩn như: Bacillus subtilis, B.mycoides; Pseudomonas fluorescents, P.cepacia; Pimelobacter sp; Agrobacterium radiobacter k84 không gây bệnh và một số loại vi khuẩn đối kháng khác đã và đang được sử dụng trong phòng trừ bệnh hại cây trồng [15]. Ngoài vi khuẩn đối kháng, các chủng vi nấm cũng được nghiên cứu sử dụng để ức chế tác nhân gây bệnh cho cây và một vài chủng đối kháng đã được thương mại hóa. Một số vi nấm như: Acemonium Kiliense; Chactomium globosum; Coniothyrium minitans; Fusarium oxysporum no pathogens; Trichoderma spp; Penicillium oxalcum và một số nấm đối kháng khác cũng được sử dụng trong phòng trừ bệnh cây. Các loài nấm này đều có nguồn gốc trong đất, đó là các vi sinh vật sống hoại sinh trong đất, sống ở vùng rễ cây trồng. Trong quá trình sống các vi sinh vật này sản sinh ra chất kháng sinh có tác dụng ức chế, kìm hãm cạnh tranh và tiêu diệt nấm gây bệnh. Năm 1994, Wang wei và đồng tác giả đã chỉ ra rằng Trichoderma viride kháng rất mạnh F.oxysporum sp.tracheiphilum và F.oxysporum sp.lycopersici gây bệnh cho đậu tương và cà chua [94]. Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện sinh học nhiệt đới cũng chỉ ra hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm này có khả năng tiêu diệt nấm F.oxysporum; R.solani; Phytophthora sp, Sclerotium rolfsii...Ngoài ra nấm Trichoderma còn có khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng cho cây trồng [78]. Đã có một số nghiên cứu về nguyên nhân và biện pháp phòng trừ bệnh cho cây tiêu. Qua nghiên cứu, tìm, phân lập, các nhà Khoa học Đại học Nông Lâm Huế đã phát hiện trong rễ cây tiêu có vi khuẩn Pseudomonas, là vi khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh chết nhanh Phytophthora capsici trên cây tiêu. Trong đề tài NCCB MS. 82.03.04 “Nghiên cứu một số nguồn gen vi sinh vật phân lập tại Việt nam kháng F. Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 12 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 oxysporum” của Viện Công nghệ sinh học đã phân lập và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học trên một số đối tượng cây trồng công nghiệp bước đầu đã cho kết quả dương tính. Các chủng vi sinh vật đã được nghiên cứu và phân loại bằng kỷ thuật sinh học phân tử [7,8]. Với đề tài KC04- 04, đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi nấm đối kháng F.oxysporum gây bệnh thối rễ cà phê và tiêu, phân lập từ đất rễ cây cà phê ở Đắc Lắc và sơ bộ định loại đến chi Gliocladium và Trichoderma, hai chủng vi nấm khác(Metarhizium và Beauveria) có khả năng diệt côn trùng và mối. Ngoài ra, đã chọn được 2 chủng vi khuẩn đối kháng tốt F. oxysporum và Ralstonia solanacearum (thuộc chi Bacillus), 8 chủng khác có hoạt tính đối kháng nhưng yếu hơn. Cơ chế đối kháng nấm của các chủng rất khác nhau, có chủng ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm, nhưng cũng có chủng làm gãy các khuẩn ty khí sinh của nấm gây bệnh. Trên thế giới và ở Việt Nam gần đây đã tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm gây bệnh ở thực vật. (như Streptomyces spp; Streptomyces griseus; Streptomyces longisporus...) [88,92]. 2.1.2.Tình hình nghiên cứu ngoài nước Các nguồn bệnh nấm thực vật rất đa dạng và gây bệnh ở những phần khác nhau của thực vật như rễ, thân, lá, quả…Phần lớn những nghiên cứu kiểm soát sinh học bệnh nấm cây tập trung vào các bệnh từ đất. Theo kết quả của nhiều nghiên cứu, một số tác nhân kiểm soát sinh học được sử dụng cho hạt và đất để giảm tỉ lệ mắc bệnh nấm cho thực vật. Sử dụng chủng Trichoderma harzianum 1295-22 ức chế đáng kể độ nặng của bệnh cây trong giai đoạn mắc bệnh sớm, có khả năng do giảm mật độ nguồn bênh trong đất (Heydari & Pessarakli, 2010)[54]. Bổ sung các chất khác vào nhân tố kiểm soát sinh học có thể tăng hiệu quả ức chế nguồn bệnh, ví dụ Triton X-100, Pelgel hoặc Tween 20. Rải chế phẩm chứa Trichoderma hoặc phun T.harzianum vào đất có thể tạo quần thể ổn định và hiệu quả trong đất, làm giảm bệnh thối rễ, bệnh nâu và bệnh tàn rụi do Pythium gây ra. Pythium, Rhizoctonia và Sclerotia là những nguồn bệnh đất quan trọng của rất nhiều loài thực vật và sự tồn tại của chúng trong đất như nguồn bệnh đầu tiên. Vì vậy, việc ức chế nguồn bệnh này là bước đầu tiên để kiểm soát bệnh ức chế sự nhiễm lần 2 và phân tán bệnh cũng là bước quan trọng trong kiểm soát bệnh cây. Ngoài Trichoderma và một số loại nấm đối kháng khác, các loài vi khuẩn đối kháng như P.fluorescens, P.putida, P.aerofaciens, Burkholderia cepacia, B.subtilis, B.polymixa cũng được áp dụng thành công trong kiểm soát các bệnh nấm thực vật (Heydari et al., 2007)[53]. Việc sử dụng và áp dụng kiểm soát sinh học bệnh cây ở mức độ thương mại chậm do kết quả thay đổi dưới các điều kiện môi trường khác nhau ngoài thực tế. Rất Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 13 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 nhiều nhân tố kiểm soát sinh học có hiệu quả cao trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà kính, nhưng hiệu quả thấp ngoài đồng ruộng. Vấn đề này có thể giải quyết khi hiểu được ảnh hưởng của những thông số môi trường lên nhân tố kiểm soát sinh học. Ngoài ra, việc đầu tư phát triển và sản xuất các chế phẩm thương mại chứa các vi sinh vật có hoạt tính kiểm soát sinh học còn ít có lẽ do kinh phí để phát triển, thử nghiệm, đăng ký và tiếp thị các sản phẩm này [53],[54]. Hiện nay, những tiến bộ cơ bản trong tin học, sinh học phân tử, hóa phân tích và thống kê dẫn tới những mục đích nghiên cứu mới để mô tả cấu trúc và chức năng của các tác nhân kiểm soát sinh học, các nguồn bệnh và thực vật chủ ở mức phân tử, tế bào và sinh thái. Một vài tiêu chuẩn sẽ nâng cao sự hiểu biết của chúng ta về kiểm soát sinh học và những điều kiện tối ưu để kiểm soát sinh học đạt hiệu quả cao nhất, đó là: (i) sinh thái của vi sinh vật đối kháng. Trong lĩnh vực này cần nghiên cứu sự phân bố của nguồn bệnh và các tác nhân đối kháng trong môi trường; các điều kiện tối ưu mà ở đó vi sinh vật kiểm soát sinh học thể hiện khả năng ức chế nguồn bệnh của chúng; phản ứng của quần thể vi sinh vật bản địa và đưa từ ngoài vào đối với các kỹ thuật canh tác khác nhau; nhân tố quyết định để vi sinh vật kiểm soát sinh học định cư thành công và biểu hiện hoạt tính; thành phần và động lực (dynamic) cảm ứng sự bảo vệ ở vật chủ (Heydari & Pessarakli, 2010)[54]. Các chủng vi sinh vật đối kháng như vi khuẩn Bacillus subtilis, xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes , vi nấm penicilium oxalicum được phân lập và tuyển chọn tham gia làm chế phẩm phân bón chức năng cho một số cây tiêu của tỉnh Quảng Trị. Trong sản xuất chế phẩm vi sinh làm phân bón cho cây trồng hay chế phẩm xử lý môi trường đòi hỏi phải có một lượng sinh khối đủ lớn để phối trộn vào các sản phẩm ứng dụng. Vì vậy, mục tiêu lựa chọn được môi trường lên men thích hợp cho các chủng nghiên cứu là một trong những nhân tố quyết định và rất quan trọng. Đã có một số công bố về khảo nghiệm và sử dụng chế phẩm sinh học và chế phẩm chitosan ở cả Việt Nam và trên thế giới. Chế phẩm vi sinh E.M (Effective Microorganisms) có nguồn gốc từ Nhật Bản và được đưa vào Việt Nam từ tháng 4/1997. E.M là chế phẩm sinh học tập hợp hơn 80 chủng vi sinh vật khác nhau, trong đó có 5 loài vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí thuộc các nhóm: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn sống cộng sinh trong cùng môi trường. Ở nước ta, chế phẩm E.M đã được sử dụng trong trồng trọt để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng. Ngoài ra còn một số chế phẩm vi sinh khác cũng đang được sử dụng để kiểm soát bệnh cho cây trồng như chế phẩm sinh học BIMA (chứa nấm đối kháng Trichoderma); EMINA; Trichoderma-B; Trichoderma – Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 14 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 H,…cũng đã cho kết quả khả quan trong việc giảm thiểu nguồn bệnh và tăng năng suất, chất lượng cây trồng. 2.2.Một số bệnh hại chính trên cây tiêu do vi sinh vật Hiện nay có nhiều bệnh hại cây tiêu, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm (chết nhanh, chết chậm, thán thư, đen lá, khô vằn, nấm hồng, tiêu điên...), nhưng tàn phá nặng nhất và gây thiệt hại cho hồ tiêu Quảng Trị là bệnh chết nhanh và chết chậm. 2.2.1.Bệnh chết nhanh. Hình 1. Cây tiêu bị nhiễm Phytophthora spp Nói đến cây tiêu trước hết là nói đến bệnh hại, trong đó quan trọng nhất vẫn là bệnh thối gốc chết dây hay còn gọi là chết nhanh ( Quick wilt, Phytophthora foot rot). Đây được coi là bệnh hại nặng nhất trên cây tiêu, hằng năm làm giảm năng suất tiêu 5-10% (Kueh, 1990)[66] và lên đến 95% ở một số hộ trồng tiêu (Manohara et al. 2004) [69]. Ở Việt Nam, bệnh xảy ra với mức độ cao nhất trong mùa mưa (tháng 5 -Tháng 11). Đầu tiên nấm xâm nhiễm vào lá phía trên gần mặt đất, sau đó lan truyền các lá bên cạnh. Người nông dân và cán bộ kỹ thuật không phát hiện được bệnh cho đến khi phần trên của cây tiêu xuất hiện các triệu chứng của vàng lá, héo rũ (Nguyễn Tăng Tôn, 2005)[75]. Khi các triệu chứng được biểu hiện thì sự lây nhiễm đã ở giai đoạn nghiêm trọng, hầu hết các gốc bị mục nát và thân ngầm xuất hiện vết bệnh có màu nâu đen. Lúc này, các vi sinh vật xâm nhập vào rễ bị bệnh. Bệnh do nấm Phytophthora spp. gây ra. Nấm Phytophthora spp. có nguồn gốc thủy sinh nên chúng ưa thích và rất cần sự ẩm ướt để sinh sản, phát triển và gây hại. Bệnh phát triển, lây lan mạnh trong mùa mưa, nhiệt độ không khí trên dưới 30ºC. Bệnh có thể xâm nhập và gây hại ở tất cả các bộ phận của cây từ thân, lá, hoa, trái cho đến cổ rễ và rễ. Nhưng nguy hiểm nhất và làm cho cây tiêu bị chết hàng loạt là khi nấm tấn công vào phần cổ rễ và rễ.Triệu chứng là cây tiêu đang tươi tốt thì xuất hiện một ít lá bị vàng úa, sau đó các lá tiếp tục bị vàng, cây tiêu héo rũ rất nhanh, có khi lá héo rũ trên cây, đến sáng sớm có Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 15 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 thể thấy cây tiêu tươi trở lại do ướt sương vào ban đêm. Sau đó các đốt thân cũng biến màu thâm đen và rụng. Hiện tượng rụng lá và đốt thường bắt đầu từ ngọn trở xuống. Bệnh xâm nhiễm vào cây tiêu bắt đầu ở vùng cổ (ngang mặt đất) hoặc phần bên dưới mặt đất làm thối cổ rễ và thối đen rễ, sau đó phần hư thối này lan dần lên trên và cây tiêu biểu hiện các triệu chứng như đã nêu. Bênh tiến triển rất nhanh từ khi phát hiện thấy lá tiêu hơi rũ xuống cho đến khi lá rụng ào ạt có khi chỉ 5-7 ngày và đến khi tiêu chết hoàn toàn có thể trong vòng 1-2 tuần [6]. 2.2.2. Bênh chết chậm (vàng lá, thối rễ) Bệnh vàng lá thối rễ hồ tiêu (chết chậm) cho thấy cây có triệu chứng sinh trưởng chậm, lá chuyển sang màu xanh sang xen kẻ màu vàng, sau đó màu vàng nhạt và dần dần vàng cả lá (Phan Quốc Sủng, 2000)[77]. Bệnh xuất hiện khi cây bị nhiễm các đối tượng Meloidogyne incognita, Radopholus similis hoặc nhiễm các loại nấm có sẵn trong đất (Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Pythium sp.). Bệnh này làm cây tiêu sinh trưởng chậm, èo uột, rụng đốt, thối rễ và gốc, phần mạch dẫn nhựa thân dây có màu nâu đen. Từ khi cây bệnh đến khi cây chết kéo dài vài ba tháng đến một năm. Bệnh “chết chậm” do nấm Fusarium oxysporum hay do tác nhân khác gây ra thường xuất hiện và gây hại nặng trên những vườn tiêu bị ngập úng, thoát nước kém, ít thoáng khí, bón thừa đạm [2]. Nguyên nhân gây ra bệnh chết chậm không chỉ do tuyến trùng hoặc nấm mà là sự tương tác của tuyến trùng và nấm. Cụ thể là M. incognita, R. similis, F. oxysporum và F. solani xâm nhập vào hại bộ rễ thông qua các vết thương do tuyến trùng gây ra, các vết thương do côn trùng như rệp sáp chích hút, làm đứt rễ, vết thương khi xới xáo bón phân. Bệnh xuất hiện và gây hại nặng trên những vườn tiêu bị ngập úng, thoát nước kém, ít thoáng khí, bón thừa đạm(Phan Quốc Sủng, 2000) [77], [1]. Bệnh này làm cây tiêu sinh trưởng chậm, èo uột, rụng đốt, thối rễ và gốc, phần mạch dẫn nhựa thân dây có màu nâu đen. Từ khi cây bệnh đến khi cây chết kéo dài vài ba tháng Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 16 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 Hình 2. Triệu chứng cây tiêu bị nhiễm Fusarium oxysporum 2.3. Kỹ thuật quan sát các đặc điểm hình thái của nấm trên môi trường nuôi cấy Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh. Những đặc điểm hình thái cơ sở để nhận biết nấm bao gồm: hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng; hình thái túi bào tử; sự hiện diện của bào tử vách dây và sợi nấm trương phồng; sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức hữu tính là cùng tản hay khác tản. Kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao phải kết hợp đồng thời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hóa hay sinh học phân tử. Tuy nhiên chúng tôi lựa chọn phương pháp định danh này cho thí nghiệm của mình vì với số lượng chủng cần định danh nhiều thì sử dụng phương pháp này lại thuận lợi mà giá thành lại rẻ hơn so với các phương pháp định danh khác. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử: Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt trong lĩnh vực Công nghệ sinh học và sinh học phân tử đã mở ra hướng mới trong phân loại vi sinh vật. Nếu như trước đây theo phương pháp cổ điển, người ta thường dựa vào những đặc điểm hình thái, cấu trúc, sinh lý, sinh hóa thì ngày nay, phương pháp xác định trình tự 16S ARN riboxom là một công cụ đắc lực giúp các nhà phân loại học trong việc định loại chính xác hơn nữa các chủng vi sinh vật. Theo Brock (2000) thì : "Loài vi khuẩn là tập hợp các chủng có quan hệ gần gũi (có trình tự rARN 16S tương đồng >97 % và tỷ lện lai ADN >70%) đủ để phân loại các chủng khác và được công nhận là một đơn vị phân loại" [82]. 2.4. Các chủng vi sinh đối kháng phù hợp cho cây tiêu tại Quảng Trị Các chủng vi sinh vật đối kháng như vi khuẩn Bacillus subtilis, xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes, vi nấm Penicilium oxalicum được phân lập và tuyển chọn để làm chế phẩm phân bón chức năng cho cây tiêu của tỉnh Quảng Trị. Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 17 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 Trong sản xuất chế phẩm vi sinh làm phân bón cho cây trồng hay chế phẩm xử lý môi trường đòi hỏi phải có một lượng sinh khối đủ lớn để phối trộn vào với các phụ gia ứng dụng. Vì vậy, mục tiêu lựa chọn được môi trường lên men thích hợp cho các chủng nghiên cứu là một trong những nhân tố quyết định và rất quan trọng. Các môi trường dinh dưỡng nhân tạo cần cung cấp đầy đủ năng lượng, các vật liệu xây dựng tế bào, và đảm bảo cho hiệu suất sinh tổng hợp cao. Nguồn dinh dưỡng mà tất cả các cơ thể cần phải có (1) nguồn nitơ, (2) nguồn cacbon. (3) các nguyên tố đa, vi lượng nhất định. Các nguyên tố hóa học chính cần cho sự phát triển của tế bào là cacbon, hydro, oxy, photphat, nitơ, lưu huỳnh, magiê và sắt. Ngoài ra, các nguyên tố khác, gọi là vi lượng, cần cho sự phát triển ở một lượng cực nhỏ (mangan, coban, kẽm, molibden, nikel và đồng) có thể có thêm vitamin (B1, B12...). Các nguyên tố này có thể tồn tại trong các dạng hóa học khác nhau, và vi sinh vật có khả năng sử dụng các hợp chất này khác nhau, dựa vào đó để xác định thành phần dinh dưỡng và đặc điểm của vi khuẩn. Vi khuẩn phát triển qua 4 giai đoạn: pha lag- đầu tiên vi khuẩn phát triển chậm, trong khi chúng làm quen với thức ăn và dinh dưỡng trong môi trường sống mới; pha log- một khi bộ máy trao đổi chất hoạt động, chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở theo hàm mũ, nhân đôi số lượng sau một vài phút; pha ổn định (stationary) càng nhiều vi khuẩn cạnh tranh nguồn thức ăn và dinh dưỡng đang cạn kiệt, sự phát triển nhảy vọt dừng lại và lượng vi khuẩn ổn định; pha chết- các chất thải độc hại tích trữ, thức ăn cạn kiệt và vi khuẩn bắt đầu chết. Chính vì vậy các nhà khoa học nghiên cứu về vi sinh vật luôn cố gắng tạo môi trường nuôi cấy tối ưu trong phòng thí nghiệm. Tối ưu hóa thành phần môi trường: Để chọn được môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy và nhằm mục đích thu được sản phẩm tối đa do chủng tạo ra là một quá trình lâu dài, đòi hỏi phải có kiến thức sâu về sinh lý, sinh hóa vi sinh vật. Thành phần môi trường tối ưu được chọn lọc theo 2 cách: chọn lọc thực nghiệm lâu dài qua nhiều giai đoạn và toán học mô hình hóa thử nghiệm. Cách thứ nhất phổ biến trong công tác nghiên cứu vi sinh vật học. Trên cơ sở hiểu biết về vi sinh vật người ta xác định thành phần môi trường, còn nồng độ các chất được tính toán dựa vào các thí nghiệm, trong đó một cấu tử của môi trường thay đổi trong một khoảng giới hạn, còn các cấu tử khác vẫn giữ nguyên. Cách này đáng tin cậy nhưng mất nhiều thời gian. Cách thứ 2 sử dụng phương pháp toán học kế hoạch hóa thử nghiệm cho phép xác định nhanh các chế độ thành phần tối ưu của môi trường dinh dưỡng. Việc tối ưu hóa gồm hai giai đoạn cơ bản. Giai đoạn đầu làm thí nghiệm đầy đủ các yếu tố nhằm Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 18 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 xác định ý nghĩa của yếu tố nghiên cứu, xác định phương hướng và mức độ biến đổi của mỗi yếu tố trong thí nghiệm. Cơ sở của việc kế hoạch hóa thực nghiệm theo yếu tố 2 n là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể giữa n các yếu tố nghiên cứu. Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức độ trên (+) và dưới (-) khi tối ưu hóa thành phần môi trường. Trung tâm của thực hiện là mức trung bình, hay mức cơ bản (0), tức là số trung bình cộng giữa hai mức trên và mức dưới của mỗi yếu tố. Giai đoạn thứ 2 là bản thân quá trình tối ưu hóa thành phần môi trường theo phương pháp lên dốc. Trong giai đoạn này nhiệm vụ của việc tối ưu hóa là tìm một tương quan tối ưu cho các yếu tố quan trọng nhất trên cơ sở cố định các yếu tố còn lại. 2.5. Giới thiệu chung về chitin/chitosan Chitin là một polysacarit thiên nhiên mạch thẳng có trữ lượng lớn thứ hai sau xenluloza, được tách ra từ vỏ của các loại động vật giáp xác như: vỏ tôm cua, mai mực và thành tế bào nấm. Chitin được cấu tạo bởi các mắt xích N-axetyl-D-glucosamin nối với nhau bằng liên kết (1-4) glycosit hay còn gọi là (1-4)-2-axetamido-2-deoxy--Dglucan. Chitosan là sản phẩm đề axetyl hoá của chitin được cấu tạo bởi các mắt xích (1-4)-2-amino-2-đeoxy--D-glucan. Là một polycationic tự nhiên, chitin/chitosan có nhiều đặc tính quý như: tương hợp sinh học, tự phân hủy sinh học, không gây kích ứng và không độc...được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, công nghệ sinh học, xử lý nước thải, mỹ phẩm, nông nghiệp, thực phẩm, dệt nhuộm...[22] 2.5.1.Cấu trúc Cấu trúc hoá học của mạch chitin tương tự như mạch của xenluloza chỉ khác là thay nhóm -OH ở C2 của mỗi mắt xích bằng nhóm -NHCOCH3. Chitosan là dẫn xuất deaxetyl hoá của chitin, nhóm axetamit ở vị trí C-2 được thay bằng nhóm amino. Cấu trúc mạch của chitin, chitosan như sau: O O HO CH3 O OH NH HO O NH O OH O CH3 n Chitin OH O HO O NH2 NH2 HO O O OH n Chitosan Hình 3. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 19 Đề tài hợp tác với Quảng Trị Mã số: VAST.NĐP.14/12-13 Chitin có cấu trúc phân tử tương tự như xenlulozơ, mạch phân tử của chitin gồm các mắt xích N-axetyl-D-glucosamin nối với nhau bằng liên kết (14) glycosit hay 2-axetamido-2 -deoxy- -D-glucozơ. Chitosan là sản phẩm hoá của chitin có tên gọi là 2-amido-2-deoxy - -D-glucozơ. Chitin (C8H13O5N)n có ở nhiều loài khác nhau, từ các loại nấm cho đến các động vật bậc thấp. Các nguồn chính có thể tách được chitin/chitosan bao gồm: động vật biển (các loài đông vật giáp xác như tôm, cua và các loài nhuyễn thể như mực ống, mực nang sừng, lớp giun đốt Annelida, ngành ruột khoang coelenterata), côn trùng (nhện, kiến, gián, bọ cánh cứng...) và hệ vi sinh vật (thành tế bào nấm, nấm men, nấm sợi, tảo nâu, tảo xanh bào tử v.v...). Thành tế bào một số loại nấm (Zymgomycetes) chứa cả chitin cũng như chitosan và được coi là nguồn chitosan tự nhiên. Vỏ của các loài động vật chân đốt là nguồn nguyên liệu để điều chế chitin dễ dàng nhất, chứa đến 2050% chitin tính theo khối lượng khô. Vỏ tôm, mai cua là nguồn nguyên liệu phế thải từ công nghiệp chế biến thuỷ, hải sản được sử dụng để sản xuất chitin thương mại. Trong công nghệ chế biến thuỷ sản xuất khẩu của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng chế biến. Công nghệ chế biến tôm tạo ra một lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu tôm và vỏ tôm, thường chiếm 50-70% nguyên liệu ban đầu. Chitosan là sản phẩm đề axetyl hoá của chitin [22]. Do cấu trúc bán tinh thể (semi-crystalline) với các liên kết hyđro chặt chẽ nên chitin không tan trong nước và các dung môi thông thường mà chỉ tan trong dung dịch chứa LiCl như N,N-đimetyl axetamit (DMAc) chứa 5-10% LiCl và N-metyl piroliđon (NMP), hỗn hợp DMAc và NMP có chứa 5-8% LiCl thường được sử dụng khi gia công màng chitin. Một hệ dung môi khác có thể hoà tan chitin là axít tricloaxetic (TCA) và clohidrocacbon như: Clometan; diclometan; 1,1,2 tricloetan; lithium thiocyanat bão hòa, CaCl2.2H2O bão hòa trong metanol, Hexafluoroisopropyl alcohol, Hexafluoroacetone sesquihydrate, hỗn hợp 1,2-dichloroethane và axít tricloroaxetic (35:65), dung dịch bão hoà lithium thiocyanate. Tuy nhiên hầu hết các dung môi để hoà tan chitin đều độc nên không thích hợp khi ứng dụng để hòa tan chitin cho các ứng dụng trong lĩnh vực y dược học và thực phẩm. Các thông số quyết định tính tan của chitin/chitosan bao gồm: nồng độ polyme, pH, nhiệt độ, DA, khối lượng phân tử...Thông thường các polyme trải qua giai đoạn trương trước khi xảy ra hiện tượng hoà tan trong các dung môi. [22],[29],[36],[50]. 2.5.2. Độ kết tinh Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đã xác định được chitin tồn tại trong tự nhiên với 3 dạng: - chitin, - chitin và - chitin, được phân biệt nhờ vào sự sắp xếp các mạch đại phân tử trong tinh thể chitin/chitosan. -chitin được tách từ vỏ tôm, cua là Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phạm Thị Thúy Hoài Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam 20