Tài liệu Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của Nuciferin

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐẮC TÙNG BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐẮC TÙNG BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền – những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn tôi, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Văn Giang, ThS. Phạm Thị Hiền cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thiện được đề tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập ở trường. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Đắc Tùng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 3 1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây ........................................................................... 3 1.1.1 Cây sen .................................................................................................................. 3 1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen.......................................... 4 1.1.2.1 Chiết xuất...............................................................................................................4 1.1.2.2 Tinh chế và phân lập. ...........................................................................................5 1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây .................................................................................... 6 1.2 Hợp chất Nuciferin ......................................................................................................... 6 1.2.1 Công thức, tính chất .............................................................................................. 6 1.2.2 Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dƣợc liệu ....................... 7 1.2.3 Tác dụng dƣợc lý. .................................................................................................. 7 1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid) ........................................................................7 1.2.3.2 Tác dụng dƣợc lý của dịch chiết sen và của nuciferin .....................................8 1.2.3.3 Một số tác dụng dƣợc lý đã đƣợc nghiên cứu ở sản phẩm demethyl hóa .. 10 1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp demethyl hóa ............................................................. 11 1.3.1 Phƣơng pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether .......................................... 11 1.3.2 Các phƣơng pháp demethyl hóa nuciferin........................................................... 14 1.4 Các phƣơng pháp O-alkyl hóa bằng tác nhân 2-cloroethanol ...................................... 16 1.4.1 Phƣơng pháp sử dụng K2CO3 trong dung môi Acetonitril .................................. 16 1.4.2 Phƣơng pháp sử dụng K2CO3 trong dung môi DMF .......................................... 17 1.4.3 Phƣơng pháp sử dụng NaOH trong nƣớc ............................................................ 17 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................................... 19 2.1 Nguyên vật liệu ............................................................................................................. 19 2.2 Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................................... 20 2.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................................... 21 2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen ...................................................................................... 21 2.3.2 Thực hiện demethyl hóa nuciferin....................................................................... 21 2.3.3 Thực hiện O-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin bằng tác nhân EC......... 21 2.3.4 Thử tác dụng sinh học ......................................................................................... 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................................. 22 2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin ................................................................... 22 2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm ................................................................................ 23 2.4.3 Thử tác dụng sinh học ......................................................................................... 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. ....................................................... 24 3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen ............................................................. 24 3.1.1 Quy trình chiết nuciferin ..................................................................................... 24 3.1.2 Tinh chế Nuciferin. ............................................................................................. 24 3.2 Bán tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II) .............................................................................................. 24 3.2.1 Demethyl hóa Nuciferin sử dụng tác nhân HBr .................................................. 24 3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI ................. 27 3.2.3 Đề xuất quy trình bán tổng hợp sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid .. 27 3.3 Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V) ............................ 28 3.3.1 Sử dụng môi trƣờng NaOH loãng ....................................................................... 29 3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K2CO3 ............................................................ 31 3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K2CO3..................................................... 31 3.3.4 Đề xuất quy trình ................................................................................................. 32 3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của nuciferin và các sản phẩm bán tổng hợp ..................... 34 3.5 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V).......................................... 37 BÀN LUẬN ........................................................................................ 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………….…49 1. KẾT LUẬN ................................................................................................ 49 2. ĐỀ XUẤT .................................................................................................. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DMF Dimethylformamid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EC 2-Cloroethanol ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) EtOH Ethanol EtSNa Natri thioethoxid 1 H-NMR n (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) IR IUPAC (Infrared Spectroscopy) Hiệp hội Hóa học Quốc tế (International Union of Pure and Applied Chemistry) MeOH Methanol SKLM Sắc ký lớp mỏng SN2 Phản ứng thế ái nhân lƣỡng phân tử (Nucleophilic Substitution) SOD Superoxid tonc Nhiệt độ nóng chảy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số alkaloid trong lá sen…………………………………………... 4 Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm............... 19 Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm………… 20 Bảng 3.1. Khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng bán tổng hợp (II)…………………………………………………………... 26 Khảo sát lƣợng KI ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng monodemethyl hóa nuciferin…………………………………………………………... 27 Bảng 3.2. Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr)…………… 34 Bảng 3.4. Bảng 3.5. Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của nuciferin……………………………………………………………… 34 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của N-methyl-asimilobin hydrobromid (IR, KBr)……………………………………................. 35 Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid (1H-NMR, DMSO)……………… 36 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 2hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (1H-NMR, MeOD)……………… 37 Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH……………. Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD………............ 39 38 Bảng 3.10. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử……………………………………………………..... 40 Bảng 3.11. Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử……………………………………………………………. 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)……………………………………. 3 Hình 2. Công thức chung các alkaloid phổ biến trong lá sen ………………...….. 4 Hình 3. Công thức cấu tạo của nuciferin ……………………………………….... 6 Hình 4. Công thức cấu tạo nhân aporphin……………………………………….. 7 Hình 5. Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin………………………………..... 11 Hình 6. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin………. 12 Hình 7. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiCl và DMF………… 12 Hình 8. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlCl3 trong CH3CN… 12 Hình 9. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlBr3 trong CH3CN… 13 Hình 10. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng H2SO4…………….. 13 Hình 11. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và NaI……………… 14 Hình 12. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và AcOH…………… 14 Hình 13. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF….. 15 Hình 14. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac2O …………….. 15 Hình 15. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48%................................... 16 Hình 16. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K2CO3 trong dung môi CH3CN..……... 16 Hình 17. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K2CO3 trong dung môi DMF ………… 17 Hình 18. Phản ứng O-alkyl hóa trong môi trƣờng NaOH loãng…………………. 17 Hình 19. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48%.................... 25 Hình 20. Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin. 26 Hình 21. Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin 26 Hình 22. Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin……… 28 Hình 23. Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin………………… 29 Hình 24. Cấu trúc sản phẩm phụ (VI) của phản ứng O-alkyl hóa……………….. 30 Hình 25. Cấu trúc sản phẩm phụ (VII) của phản ứng O-alkyl hóa………………. 31 Hình 26. Quy trình đề xuất cho phản ứng O-alkyl hóa chất (II) để tổng hợp sản phẩm thế của nuciferin: 2-Hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V)……………… 33 Hình 27. Vai trò xúc tác của KI trong phản ứng demethyl hóa………………….. 42 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nhiều quốc gia trên thế giới, nhất là ở các nƣớc đang phát triển, xu thế con ngƣời bắt đầu sử dụng nhiều các loại thuốc chữa bệnh và bồi dƣỡng sức khỏe có nguồn gốc từ thảo dƣợc hơn là sử dụng thuốc tân dƣợc vì nó ít độc hại hơn và ít tác dụng phụ hơn. Hơn nữa, hiện còn nhiều triệu chứng và bệnh hiểm nghèo chƣa có thuốc đặc hiệu để chữa trị, ngƣời ta hi vọng rằng từ nguồn động thực vật tự nhiên hoặc từ vốn trí tuệ bản địa của các cộng đồng, qua nghiên cứu sàng lọc có thể cung cấp cho nhân loại những hợp chất có hoạt tính sinh học cao để làm ra các loại thuốc mới có hiệu quả chữa bệnh nhƣ mong muốn [1]. Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn dƣợc liệu phong phú đa dạng làm thuốc với những bài thuốc y học cổ truyền đã có hiệu quả trong việc phòng và chữa trị nhiều bệnh. Những tác dụng cũng nhƣ chất lƣợng của những bài thuốc đang dần dần đƣợc chứng minh và kiểm soát. Trong rất nhiều loại dƣợc liệu đƣợc sử dụng để chữa bệnh, có Sen là một loài rất phổ biến ở Việt Nam. Sen tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen – Nelumbonaceae. Từ xƣa đến nay sen đã đƣợc sử dụng trong rất nhiều bài thuốc y học cổ truyền ở các nƣớc phƣơng Đông nhƣ Việt Nam, Trung Quốc,.. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của sen. Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7-0,8%, với nuciferin là alkaloid chính. Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra đƣợc rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các bộ phận cây sen cũng nhƣ của nuciferin, điển hình nhƣ tác dụng chống ung thƣ [36], chống HIV [41], chống tăng lipid máu [36], hay có tác dụng chống oxy hóa mạnh [37]. Nhờ có ƣu thế về nguồn nguyên liệu cây sen cũng nhƣ là tiềm năng của nó trong y dƣợc học, cây sen trong những năm gần đây đƣợc đƣa vào nghiên cứu rất nhiều ở Việt nam. Với nguồn nguyên liệu nuciferin sẵn có và dễ tách 2 chiết với hiệu suất cao, việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là một hƣớng phát triển để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh. Đề tài “Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Bán tổng hợp một số dẫn chất nuciferin. 2. Thử tác dụng chống oxy hóa của các dẫn chất bán tổng hợp đƣợc. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây 1.1 1.1.1 Cây sen Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen – Nelumbonaceae. Phân bố: Vùng nhiệt đới châu Á, Châu Mĩ và ở Việt Nam. Đặc điểm thực vật: Cây mọc dƣới nƣớc, sống nhiều năm. Thân rễ hình trụ mọc bò lan trong bùn, lá hình tròn mọc lên khỏi mặt nƣớc, cuống dài có gai, đính ở giữa phiến lá, mép lá uốn lƣợn tròn. Hoa to màu hồng Hình 1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) hay trắng có mùi thơm. Nhiều lá noãn chứa trong một đế hoa chung hình nón ngƣợc sau thành quả có vỏ cứng màu nâu đen. Cây Sen đƣợc trồng ở các ao hồ khắp nơi trong nƣớc ta. Mùa thu hái: tháng 7 – 9 [6,7]. Thành phần hóa học: Lá sen có chứa alcaloid (0,77 – 0,84%), trong đó có nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, Onorciferin, armepavin, N-nor-armepavin, methyl-corlaurin, nepherin, dehydroemerin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisocorlaurin. Trong đó nuciferin là alcaloid chính. Ngoài ra trong lá sen còn có flavonoid, tanin, acid hữu cơ. Trong tâm sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%), trong đó có liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, methylcorypallin, demetylcorlaurin [3,6,7,12]. nuciferin, pronuciferin, 4 Hình 2. Công thức chung các alkaloid phổ biến trong lá sen Bảng 1.1. Một số alkaloid trong lá sen Một số Alkaloid R1 R2 R3 Nuciferin CH3 CH3 CH3 N – nor – Nuciferin CH3 CH3 H O – nor – Nuciferin H CH3 CH3 Roemetine - CH2 - CH3 Anonaine - CH2 - H Công dụng: Alcaloid toàn phần trong lá sen có tác dụng an thần, hạ huyết áp nhẹ. Lá sen đƣợc dùng để sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 – 20 g/ngày. Lá sen kết hợp với một số dƣợc liệu khác làm thuốc an thần. Tâm sen chữa mất ngủ, an thần, di mộng tinh. Ngày dùng 4 – 10 g dƣới dạng thuốc hãm hay sắc uống [6,7]. 1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen 1.1.2.1 Chiết xuất - Phƣơng pháp chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trƣờng kiềm: Chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá sen, tâm sen, gƣơng sen theo cùng qui trình sau: Bột dƣợc liệu đƣợc làm ẩm bằng NH4OH 10% sau đó chiết bằng cồn 70o. Dịch chiết cồn đƣợc cất dƣới áp suất giảm để thu hồi cồn. Hòa tan cắn vào nƣớc, acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 2. Lọc loại bỏ cặn. Dịch lọc acid đƣợc chiết bằng ether dầu hỏa để loại tạp. Dich chiết acid đƣợc thêm NH4OH 10% đến pH 5 = 10 – 11 rồi chiết bằng CHCl3. Dịch chiết CHCl3 đƣợc cất thu hồi dung môi, còn lại cắn alcaloid toàn phần [5]. - Phƣơng pháp chiết bằng cồn: Bột lá sen đƣợc chiết bằng cồn lạnh trong 4 ngày. Dịch chiết đƣợc cô thành cắn dƣới áp suất giảm. Sau đó hỗn hợp đƣợc chiết cân bằng giữa 2 pha CHCl3 và dung dịch NH4OH 5%. Lấy pha hữu cơ, rửa lại bằng nƣớc, lắc vài lần với HCl 2N vài lần (pha acid sẽ lấy đi tạp dạng dầu màu nâu). Pha CHCl3 đƣợc cô ở áp suất giảm thu đƣợc cặn, nghiền nhỏ trong dung dịch NH4OH ấm sau đó chiết bằng CHCl3. Lấy pha hữu cơ, làm khan, cô dƣới áp suất giảm thu đƣợc cắn alkaloid toàn phần [6, 11]. 1.1.2.2 Tinh chế và phân lập. - Phân lập alcaloid bằng sắc kí cột sử dụng silica gel 60 GF254(Merck): Hoạt hóa silica gel ở nhiệt độ 110oC trong 1 giờ. Lắc silica gel với hệ dung môi đã chọn thành hỗn dịch, rót từ từ vào cột, sau đó cho dung môi chảy qua liên tục với thời gian là 5 giờ để ổn định cột. Cắn alkaloid toàn phần ở trên đƣợc hòa vào một lƣợng nhỏ với hệ dung môi đã chọn tạo thành dịch alkaloid đậm đặc rồi trộn với một lƣợng silica gel vừa đủ đƣa vào cột sắc kí đã chuẩn bị ở trên. Rửa giải bằng hệ dung môi đã chọn theo tỉ lệ độ phân cực tăng dần. Tốc độ chảy khoảng 30 giọt/phút, hứng mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào các ống nghiệm riêng và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng. Chọn riêng các phân đoạn chỉ có một vết trên sắc kí đồ, bốc hơi dung môi thu đƣợc cắn alcaloid. Kết tinh lại nhiều lần sẽ thu đƣợc alkaloid tinh khiết. Riêng các phân đoạn có 2 hoặc 3 vết đƣợc tiến hành phân lập tiếp bằng sắc kí lớp mỏng điều chế [3,6]. - Phân lập alcaloid bằng sắc kí lớp mỏng điều chế: Chấm dung dịch chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thƣớc 20 x 20 cm đƣợc tráng chất hấp phụ là silica gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ. Hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH : NH4OH = 50 : 9 : 1. Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó phun thuốc thử Dragendorff lên 6 một góc để phát hiện và đánh dấu vết alcaloid. Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng CHCl3 và lọc. Để CHCl3 bốc hơi tự nhiên, sau đó hòa tan lại bằng cồn ethanol rồi để tủ lạnh, cho kết tinh lại nhiều lần thu đƣợc 2 alcaloid tinh khiết là KN1 và KN2. Qua phân tích cấu trúc nhận dạng đƣợc KN1 là nuciferin [3,6]. 1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây Một số sản phẩm chứa cao lá sen: Chế phẩm Sen vông của xí nghiệp dƣợc phẩm Trung ƣơng 2 chứa cao lá sen, cao lá Vông, lƣu hành tại thị trƣờng Việt Nam và xuất khẩu; chế phẩm Sevona của xí nghiệp dƣợc phẩm Trung ƣơng 25 chứa cao lá sen và một số dƣợc liệu khác, lƣu hành tại Việt Nam và xuất khẩu sang các thị trƣờng Nhật, Cuba, một số nƣớc Châu Âu; chế phẩm trà thuốc Seivo của trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi và ích mẫu; chế phẩm thuốc an thần Seroga của xí nghiệp dƣợc phẩm Trung ƣơng 25 chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi, cao táo nhân và cao thiên ma. 1.2 Hợp chất Nuciferin 1.2.1 Công thức, tính chất - Công thức phân tử: C19H21NO2. - Khối lƣợng phân tử: 295,2. - Danh pháp: 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2- dimethoxy-6-methyldiabenzoquinolin [2,3]; hoặc (IUPAC) 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7- tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin; 1,2- dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4Hdibenzo[de,g]quinolin; (+-)-1,2-dimethoxy-6- methyl-aporphin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin [12]. Hình 3. Công thức cấu tạo của nuciferin 7 - Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl 3, MeOH, EtOH nóng, hầu nhƣ không tan trong nƣớc, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165 0C, phổ UV (đo trong MeOH) cho λmax tại bƣớc sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [2,3]. - Phổ 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 7,48 (3H, s, N-CH3), 6,40 (3H, s, C1- OCH3), 6,16 (3H, s, C2-OCH3), 3,38 (1H, s, C3-H). 2,74 (3H, m, C8-H + C9-H + C10-H). 1,60 (1H, d, C11-H) [3,11,12]. 1.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu - Chiết xuất: Sủ dụng phƣơng pháp chiết nhƣ phần 1.2.2.1 thu đƣợc alkaloid toàn phần. - Phân lập và tinh chế: Sử dụng phƣơng pháp kết tinh lại trong cồn nóng thu đƣợc tinh thể màu trắng ánh xanh nhạt. 1.2.3 Tác dụng dược lý. 1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid) Trong những năm gần đây, tác dụng của các alkaloid có nhân aporphin đang là chủ đề của rất nhiều nghiên cứu bởi mối liên hệ với cấu trúc nhân apomorphin cũng nhƣ là các tác dụng không thể không thừa nhận của các bài thuốc y học cổ truyền có chứa những alkaloid trên, chính vì thế nhiều nghiên cứu về các aporphinoid đã đƣợc thực hiện. Sau đây là một số tác dụng đƣợc lý chung Hình 4. Công thức cấu tạo nhân aporphin của các aporphinoid đã đƣợc tìm thấy: - Tƣơng tác với các receptor thuộc hệ dẫn truyền thần kinh. - Tác dụng gây co cơ. - Ảnh hƣởng đến hoạt động của nhiều enzym. - Tác dụng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do. 8 - Ảnh hƣởng đến quá trình kết tập tiểu cầu. - Hạ huyết áp và chống loạn nhịp tim. - Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus. - Gây độc tế bào và tác dụng chống khối u. - Tác dụng miễn dịch. - Tác dụng chống viêm và tác dụng vảo vệ tế bào. - Tác động gây đột biến, gây độc cho gen và phá hủy cấu trúc nhiễm sắc thể [22,39]. 1.2.3.2 Tác dụng dược lý của dịch chiết sen và của nuciferin Với y học cổ truyền, ngƣời ta sử dụng các bộ phận của cây sen trong những bài thuốc khác nhau dung để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, ngày nay khoa học đã chứng minh đƣợc nhiều tác dụng của những bài thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ các alkaloid có trong sen (nuciferin là alkaloid chính) cũng nhƣ tìm ra nhiều tác dụng mới của sen. - Tác dụng chống HIV: Với một số alkaloid đƣợc phân lập từ lá Nelumbo nucifera ( Nymphaceae ), ngƣời ta đã chứng minh đƣợc tác dụng chống HIV tốt thông qua các đánh giá các giá trị EC50 và TI (chỉ số điêu trị). Nuciferin là alkaloid chính trong lá và phôi của Nelumbo nucifera, đây là một alkaloid aporphin, tác dụng chống HIV ở EC50 là 0,8 µg/ml và TI là 36 [41]. - Tác dụng chống oxy hóa: Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết cồn của hạt Nelumbo nucifera để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vitro và in vivo. Tổng hàm lƣợng của các phenolic trong dịch chiết đƣợc tìm thấy là 7,61 ± 0,04% ( kl/kl). Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng dọn gốc tự do tốt thể hiện qua các giá trị IC50 thu đƣợc. Tác dụng chống oxy hóa sử dụng phƣơng pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) cho IC50 có giá trị là 6,12 ± 0,41 µg/ml. Còn với phƣơng pháp sử dụng nitric oxid là 84,86 ± 3,56 µg/ml. Các giá trị IC50 ở trên đều ít hơn so với giá trị IC50 ở rutin trong thử tác 9 dụng chống oxy hóa với các phƣơng pháp tƣơng tự. Ngoài ra, ngƣời ta đánh giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ , không thấy có dấu hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lƣợng cơ thể. [37]. - Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid đƣợc chiết đƣợc từ lá sen đã đƣợc thử nghiệm. Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã đƣợc thử nghiệm thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống nấm. Tuy nuciferin không có tác dụng này, nhƣng ngƣời ta phát hiện ra một mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có liên quan mật thiết với nhóm thế ở vị trí C1 và C2 trên vòng aporphin (hình 5). Đây đƣợc coi là một hƣớng nghiên cứu mới với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này ở nuciferin [40]. - Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích tiết insulin in vitro tốt hơn Glyburid. Cơ chế kích thích tiết insulin bằng cách đóng các kênh K+ - ATP , giải thích tác dụng chống bệnh tiểu đƣờng của Nelumbo nucifera [27,28]. - Dịch chiết ethanol của sen có tác dụng chống béo phì ở ngƣời, đồng thời có tác dụng chống béo phì và chống oxy hóa ở chuột đƣợc cho ăn một chế độ giàu chất béo [19]. - Dịch chiết lá sen có đặc tính ức chế mạnh CYP2D6 in vitro (CYP2D6 là một enzyme trong hệ thống Cytochrome P450 có liên quan đến chuyên hóa các thuốc trong cơ thể). Kết quả cho thấy dịch chiết cồn ức chế mạnh mẽ CYP2D6 với giá trị IC50 là 12,05 µg/mL và ức chế yếu các enzym khác . Ngoài ra, phần alkaloid trong dịch chiết gây một tác dụng ức chế rõ rệt hơn về hoạt động CYP2D6 với giá trị IC50 là 0,96 µg/mL . Ba alkaloid aporphin phân lập từ hỗn hợp alkaloid (nuciferin, nornuciferin, và 2-hydroxy-1-methoxyaporphin) ức chế đáng kể CYP2D6 với giá trị IC50 tƣơng ứng là 3,78 , 3,76 và 3,15 µM [32]. - Một nghiên cứu tổng quan vào năm 2007 trên ―Journal of Agricultural Technology‖ đã chỉ ra rất nhiều tác dụng của sen theo y học cổ truyền nhƣ: lợi 10 tiểu, bài tiết mồ hôi, kháng nấm, hạ sốt, điều trị tiêu chảy, nôn mửa, bệnh phong…. Lá đƣợc sử dụng nhƣ thuốc hiệu quả cho các chứng nôn ra máu , chảy máu cam , ho ra máu , tiểu máu và băng huyết cơ thể trong thời gian sốt và viêm da… Ngoài ra, các tác dụng khác cũng đƣợc chứng minh bằng kỹ thuật hiện đại nhƣ: Chống oxy hóa, chống ung thƣ, kháng virus, chống béo phì,… [36]. Có thể kết luận sen và các hoạt chất có trong sen, đặc biệt là các alkaloid với nuciferin là thành phần chính có thể có rất nhiều tác dụng sinh học, tác dụng tốt với nhiều bệnh mà hiện con ngƣời vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu và chƣa tìm ra phƣơng pháp chữa hiệu quả, sen và các alkaloid trong sen có một giá trị tiềm năng lớn về mặt khoa học trong tƣơng lai. 1.2.3.3 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu ở sản phẩm demethyl hóa - Thành phần alkaloid từ nụ hoa và lá của hoa sen ( Nelumbo nucifera, Nymphaeaceae) có khả năng ức chế hoạt động tạo melanin trong các tế bào khối u ác tính B16: Dịch chiết methanol từ nụ hoa và lá của hoa sen (Nelumbo nucifera, Nymphaeaceae) đã đƣợc chứng minh là có tác dụng ức chế hoạt động tạo của khối u ác tính tế bào B16 4A5 ở chuột. Trong số các thành phần phân lập đƣợc, nuciferin, N-methyl-asimilobin, lirinidin, và 2-hydroxy-1- methoxy6a, 7-dehydroaporphin đã cho thấy: Nuciferin và N-methyl-asimilobin ức chế sự biểu hiện của mRNA tyrosinase ở nồng độ 3-30 µM, N- methyl-asimilobin ức chế sự biểu hiện của TRP -1 mRNA nồng độ 3-30 µM, và nuciferin ức chế sự biểu hiện của TRP- 2 mRNA ở nồng độ 10-30 µM [15]. 11 5. Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin Các alkaloid aporphin phân lập từ Nelumbo nucifera có tác dụng ức chế - acetylcholinesterase và theo điều tra ban đầu thấy có một mối tƣơng quan giữa cấu trúc và tác dụng: N-methyl-asimilobin (1), một cất ức chế mạnh acetylcholinesterase (AChE), cùng với hai alkaloid aporphin có tác dụng kém hơn là nuciferin (2) và nornuciferin (3) đƣợc tách ra từ Nelumbo nucifera. Nmethyl-asimilobin (1) ức chế 50% hoạt động của AChE ở nồng độ 1,5 ± 0,2 µg ml -1 trong khi giá trị IC50 tiêu chuẩn của Physostigmine là 0,013 ± 0,002 µg ml -1.[17]. 1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp demethyl hóa 1.3.1 Phương pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether A. Phương pháp thế ái nhân a. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Kirschk và cộng sự (1995) Điều kiện phản ứng: Sử dụng LiI và quinolin ở nhiệu độ 140–180oC trong 10–30 phút. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm demethyl hóa với hiệu suất 65–88% [29,38]. Hình 6. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin