Tài liệu Bài tập sắc ký đảo phax

SẮC KÝ PHA ĐẢO Giảng viên: TS. Nguyễn Trí Nhân Sắắc ký lỏng hiệu nắng cao (HPLC) Sắắc ký ion ion chromatography Sắắc ký hâắp phụ adsorpton chromatography Sắắc ký phân bốắ partton chromatography Sắắc ký pha thường Sắắc ký rây phân tử gel permeaton chromatography Sắắc ký pha đảo 1 GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮẮC KÝ PHÂN BỐẮ • Sắắc ký phân bốắ (partttn chrtmattgraphy) là kyỹ thuật sắắc ký mà các châắt tan được tách ra dựa vàt độ phân cực của 2 pha: pha động lỏng và pha tnh chứa giá thể. • Châắt được sử dụng làm giá thể trtng pha tnh thường là silica nhưng cũng có thể là các vật liệu khác. Hình 1. Hệ thốắng phân tch HPLC (shimadzu.ctm/an/service-supptrt/technicalsupptrt/analysis-basics/basic/what_is_hplc.htm) Hình 2. Nguyên lý của sắắc ký phân bốắ (Dale Faith Dumalagan) 2 GIỚI THIỆU PHÂN BIÊT SẮẮC KÝ PHA THUẬN VÀ SẮẮC KÝ PHA ĐẢO Sắắc ký pha thuận Nguyên lý • Pha tnh phân cực: nước,.. • Pha động ít phân cực: hexan,.. Áp dụng • Tách và phân tch các hợp châắt có độ phân cực cat Sắắc ký pha đảo Nguyên lý • Pha tnh ít phân cực: hydrtcarbtn,.. • Pha động phân cực: methantl,… Áp dụng • Phân tch các hợp châắt từ khống phân cực đêắn phân cực. • Phân tch hâầu hêắt các hợp châắt hữu cơ có mạch carbtn dài (ít phân cực) 3 GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮẮC KÝ PHA ĐẢO Pha tnh: • Dung mối khống phân cực và giá thể (silica) • Silica được gắắn thêm châắt chứa 18 carbtn (C18) htặc 8 carbtn (C8). Từ đó giúp silica từ châắt phân cực trở thành châắt khống phân cực. Hình 3. Câắu trúc giá thể được gắắn C18 htặc C8 (vinaquips.ctm/vi/tai-lieu) 4 GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮẮC KÝ PHA ĐẢO Pha động: • Chứa các dung mối phân cực cat như axettnitril, metantl và 2-prtpantl bổ sung nước. • Thành phâần có thể cốắ định htặc thay đổi (gradient nốầng độ). 5 GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮẮC KÝ PHA ĐẢO Nguyên lý: • Các phân tử phân cực seỹ khống có nhiêầu lực hút với các nhóm khống phân cực gắắn trên silica, nên seỹ di thet pha động và di chuyển nhanh. • Các phân tử khống phân cực có lực hút với các nhóm gắắn trên silica dt lực van der Waals và ít tan trtng pha động nên di chuyển chậm hơn. Hình 4. Mố hình kêắt quả HPLC (sigmaaldrich.ctm/VN/en/technical-dtcuments) 6 PHƯƠNG PHÁP • ẬT LIỆU V Thiêắt bị: • Máy dò UV • Cột tctadecylsilica (C18) đảt pha (đường kính 4,6,dài 250, kích thước hạt 5, kích thước lốỹ 300) • Thiêắt bị lọc dung mối có bộ lọc Teftn 0,22 • Bộ lọc mâỹu rốỹng 0,22 • Bufer A: 0,1% TFA (Trifturtacetc acid) • Bufer B: 100% Acettnitrile) chứa 0,1 % TFA 7 PHƯƠNG PHÁP • ương pháp Ph Chuẩn bị mâẫu: • Htà tan 1mg mâỹu trtng 1mL Bufer A • Lọc những phâần khống tan bắầng bộ lọc 0,22 Chuẩn bị dung mối: • Dung mối phải được lọc qua bộ lọc 0,22 • Nhắầm ltại bỏ các hạt bụi làm tắắt đường dung mối htặc cột và khử khí 8 PHƯƠNG PHÁP Ph • ương pháp Hiệu chỉnh cột và chạy thử: • Kêắt nốắi bộ phâần bảt vệ và cột với hệ thốắng phân phốắi dung mối HPLC và hiệu chỉnh điêầu kiện cân bắầng sau: Dung mối: 100% bufer A Tốắc độ dòng: 1mL/phút Bước sóng phát hiện: 215nm Nhiệt độ: mối trường xung quanh • Sau khi thu được đường nêần ổn dịnh, bơm vàt 10 nước siêu tnh khiêắt • Nên thực hiện hai lâần chạy thử để đảm bảt sự cân bắầng thích hợp cht cột. 9 PHƯƠNG PHÁP Phương pháp Tiêm và phân tích mẫu: • Sau khi thu được đường nền ổn dịnh, bơm vào 10�� mẫu (bằng tay hoặc kim phun tự động). • Sự dụng gradient tuyến tính từ 0-100% bufer B trong 30 phút để rửa giải mẫu. Hình 5. Sơ đồ minh hoạ quá trình tính chế peptit tổng hợp (Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography) 10 PHƯƠNG PHÁP Phương pháp Hình 1. Hệ thốắng phân tch HPLC (shimadzu.ctm/an/service-supptrt/technical-supptrt/analysisbasics/basic/what_is_hplc.htm) 11 PHƯƠNG PHÁP • Một số yếu tố ảnh hưởng Thông số hoạt động: có thể thay đổi trong quá trình phân tách • Phối tử cố định: loại n-alkyl (thường C18) ảnh hưởng đáng kể đến lưu giữ các peptit và protein nên được sử dụng để điều khiển tính chọn lọc và phân tách. • Hình dạng hình học của hạt: đường kính hạt từ 3-5 phổ biến trong sắc ký đảo pha. • Kích thước cột: phụ thuộc vào hiệu quả mong muốn và kích thước mẫu. 12 PHƯƠNG PHÁP Một số yếu tố ảnh hưởng Thông số hoạt động: có thể thay đổi trong quá trình phân tách. • Dung môi hưu cơ: axetonitril, metanol và 2-propanol, đều thể hiện độ trong suốt quang học cao trong các bước sóng phát hiện được sử dụng để phân tích peptit và protein. • Tốc độ dòng: Tuỳ theo đường kính cột sẽ có tốc dộ dòng phù hợp. Ảnh hưởng của pH đêắn kêắt quả phân tch: • Mối trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi nêần. Lúc này cột seỹ mâắt htạt tnh dâỹn đêắn châắt câần phân tch khống còn tương tác tốắt với pha tnh. • Mối trường base (pH > 7) giá thể silica có thể bị hòa tan (SiO2 thành silicat) làm sốắ nhánh ghép giảm và thời gian lưu cũng có thể giảm. Dâỹn đêắn kêắt quả phân tch mâắt đi độ chính xác. 13 PHƯƠNG PHÁP Một số yếu tố ảnh hưởng Hình 4. Mố hình kêắt quả HPLC (sigmaaldrich.ctm/VN/en/technical-dtcuments) 14 KHUYẾT ĐIỂM Thường gây biến tính protein Hình 6. Sự gắn kết của protein hoặc peptide trên nền silica (Aguilar et al.,2004) 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aguilar, M. I. (2004). Reversed-phase high-perftrmance liquid chrtmattgraphy. In HPLC of Pepties ani Proteins (pp. 9-22). Springer, Ttttwa, NJ. Carr, D. (2016). A guide tt the analysis and purifcattn tf prtteins and peptdes by reversed-Phase HPLC. Aivancei Chromatography Technologies. 16