Tài liệu Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào

11/27/2013 KHOA CNSH & KTMT BÀI GIẢNG CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CHƢƠNG MỞ ĐẦU GIỚI THIỆU MÔN HỌC ThS. Nguyễn Thành Luân Email: [email protected] ĐỀ CƢƠNG MÔN HỌC Tên học phần: CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO Mã học phần: 08220058 Số tín chỉ: 2 (2, 0, 4) Trình độ: Dành cho sinh viên đại học Hệ đào tạo: Đại học Mục tiêu môn học – Trình bày đƣợc kiến thức chung về nuôi cấy tế bào, những hiểu biết chung về môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy; – Hiểu rõ các phƣơng pháp nuôi cấy cơ bản ở các mô tế bào khác nhau nhƣ vi sinh vật, thực vật hoặc động vật. – Hiểu đƣợc sự ảnh hƣởng của các điều kiện ngoại cảnh đến khả năng nuôi cấy và sinh trƣởng, phát triển của tế bào cũng nhƣ xuất hiên các biến dị của mô hoặc tế bào sinh vật khi có sự thay đổi các yếu tố ngoại cảnh. 1 11/27/2013 Nội dung cơ bản của môn học ─ Cơ bản về nuôi cấy tế bào ─ Cấu trúc cơ bản của tế bào và sự di truyền của nó sau khi nuôi cấy. ─ Cơ chế điều hòa và hoạt động của hệ gen đối với tế bào nuôi cấy. ─ Các phƣơng pháp và kỹ thuật áp dụng cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào. ─ Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật nuôi cấy mô & tế bào. Tài liệu học tập • Sách, giáo trình chính [1] Nguyễn Hoàng Lộc. Giáo trình Công nghệ tế bào, NXB Đại học Huế. 2006 [2] Bùi Trang Việt. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục. 2005 [3] Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai, Trần Thị Việt Hồng. Sinh lý học người và động vật. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM. 2000 Tài liệu tham khảo  Novakovic, G.V. & Freshney, R.I. Culture of Specialized Cells – Culture of Cells for Tissue Engineering, Wiley-Liss, New Jersey, USA. 2006  Mather, J.P. & Roberts, P.E. Introduction to Cell and Tissue Culture: Theory And Technique, Plenum Press, New York. 1998. 2 11/27/2013 Tiêu chí đánh giá môn học  Dự lớp: 80% trở lên tính theo số tiết lên lớp  Thi giữa học phần: 0%  Thi kết thúc học phần: 70%  Khác: 30% (Thảo luận, tiểu luận…) Đánh giá tiểu luận (30%) • Seminar + tiểu luận theo nhóm • Thời gian: 15 phút/nhóm, phải có đầy đủ thành viên báo cáo • Chủ đề về 1 tài liệu chuyên ngành về: – Nuôi cấy tế bào VSV – Nuôi cấy tế bào thực vật – Nuôi cấy tế bào động vật • Chú trọng vào các phƣơng pháp nuôi cấy hiện đại, ứng dụng cao • Mỗi nhóm tiểu luận: 4 ngƣời BÁO CÁO TIỂU LUẬN • Sinh viên tự chọn lọc tên đề tài phù hợp về các lĩnh vực nuôi cấy tế bào vi sinh vật, thực vật & động vật. • Chọn lọc phƣơng pháp nuôi cấy hiện đại, theo quy trình nuôi cấy theo công nghiệp (thành phẩm). • Ƣớc lƣợng rõ ràng giá cả, phân tích ƣu và nhƣợc điểm của thiết bị và hiệu suất sử dụng cho đối tƣợng cụ thể. 3 11/27/2013 Cấu trúc bài báo cáo seminar • Bao gồm các phần: – ĐẶT VẤN ĐỀ – TỔNG QUAN – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: chú trọng – KẾT QUẢ DỰ KIẾN – THẢO LUẬN & KẾT LUẬN. – KIẾN NGHỊ (NẾU CÓ) BÁO CÁO DƢỚI DẠNG FILE PPT ĐƢỢC GHI ÂM THỜI HẠN NỘP BÀI LỚP TRƢỞNG TỔNG HỢP CÁC FILE CỦA CÁC NHÓM VÀO ĐĨA VÀ GỞI ĐĨA VỀ KHOA VÀO NGÀY 22/11/2013 (Không nhận bài sau ngày trên) BÌA ĐĨA GHI: BÀI TIỂU LUẬN MÔN….. LỚP:……………. Thi kết thúc học phần • Hình thức thi: Trắc nghiệm • Bao gồm tất cả nội dung đã đƣợc học trong toàn bộ môn học và giáo trình liên quan. Có phần câu hỏi tiếng Anh (nâng cao) • Gồm 4 phần chính: Đại cƣơng nuôi cấy tế bào, PP nuôi cấy TB VSV, Thực vật, Động vật (Có câu hỏi tiếng Anh) 4 11/27/2013 ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT STT Nội dung Số tiết 1 Chương 1: Mở đầu 2 2 Chương 2: Sinh trưởng và bất động của tế bào 4 3 Chương 3: Động học sinh trưởng của tế bào 4 4 Chương 4: Thiết kế hệ lên men 4 5 Chương 5: Nuôi cấy tế bào vi sinh vật 4 6 7 8 Chương 6: Nuôi cấy tế bào động vật Chương 7: Nuôi cấy tế bào thực vật Báo cáo tiểu luận 4 4 4 Các giảng viên phụ trách môn học • ThS. Nguyễn Thành Luân (PP nuôi cấy TB VSV - 3 tuần đầu) • ThS. Phạm Văn Lộc (PP nuôi cấy TB thực vật - 2 tuần tiếp theo) • ThS. Lại Đình Biên (PP nuôi cấy TB động vật - 3 tuần cuối) CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 5 11/27/2013 ĐẠI CƢƠNG VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO • Khái niệm Công nghệ sinh học hiện đại • Lịch sƣ̉ hình thành Công nghệ tế bào • Các quá trình sinh học trong công nghệ tế bào • Tại sao lại là: Nuôi cấy tế bào? • Các ƣu và nhƣợc điểm của công nghệ tế bào Công nghệ sinh học hiện đại • “Công nghệ sinh học hiện đại là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp mà nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật và động vật). Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này đƣợc xem nhƣ một lò phản ứng nhỏ”. Công nghệ sinh học hiện đại • Thuật ngữ “Công nghệ sinh học” thƣờng đƣợc sử dụng. Vậy CNSH là gì? • Những kỹ thuật mới nhƣ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant) và dung hợp tế bào (cell fusion), đƣợc xem là lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại. 6 11/27/2013 Câu hỏi • Hãy cho biết bản chất của phƣơng pháp DNA tái tổ hợp và dung hợp tế bào? • Các ứng dụng của 2 phƣơng pháp trên Nhu cầu của CNSH hiện đại • Các dƣợc phẩm: – Sản xuất Insulin để chữa bệnh đái tháo đƣờng – Sản xuất các Hormone sinh trƣởng ngƣời để điều trị bệnh còi của trẻ em – Các Interferon (IFNs) để chống viêm nhiễm, vaccine phòng bệnh và các kháng thể đơn dòng dùng để chẩn đoán QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐIỂN HÌNH 7 11/27/2013 Nhu cầu của CNSH hiện đại • Các con giống sạch bệnh hoặc khoẻ mạnh hơn, các vật nuôi dùng làm thực phẩm có sản lƣợng cao có thể đƣợc phát triển • Các loài cây trồng quan trọng đƣợc biến đổi di truyền để có các tính trạng chống chịu stress • Chống chịu chất diệt cỏ và kháng côn trùng • Phát triển các vi sinh vật đƣợc biến đổi di truyền (genetically modification organisms) Recombinant DNA (rDNA) - Cloning  Là những kỹ thuật cho phép thao tác trực tiếp nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt.  Có thể đƣợc sử dụng để phát triển các vi sinh vật sản xuất các sản phẩm mới cũng nhƣ các cơ thể hữu ích khác. 8 11/27/2013 Mục tiêu chính của công nghệ rDNA • Gắn một gen ngoại lai (foreign gene) mã hóa cho một sản phẩm mong muốn vào trong các dạng DNA mạch vòng (plasmid vector) của vi khuẩn • Chuyển gene vào trong một cơ thể vật chủ  gen ngoại lai có thể biểu hiện để sản xuất sản phẩm của nó từ cơ thể này. Dung nạp tế bào (cell fusion) Dung nạp tế bào • Là quá trình hình thành một tế bào lai đơn (single hybrid cell) với nhân và tế bào chất từ hai loại tế bào riêng biệt để tổ hợp các đặc điểm mong muốn của cả hai loại tế bào này. • Ứng dụng trong việc ứng dụng sản xuất tế bào lai trong sản xuất kháng thể đơn dòng, ghép mô tế bào,… 9 11/27/2013 Công nghệ nuôi cấy tế bào Các công nghệ DNA tái tổ hợp hoặc dung nạp tế bào đƣợc khởi đầu bởi những nghiên cứu thuần túy và các kết quả cuối cùng có thể phát triển thành một loại tế bào mới có thể sản xuất sản phẩm có ý nghĩa thƣơng mại CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Đòi hỏi phải phát triển thành quy trình công nghệ với các công nghệ khả thi và có hiệu quả kinh tế cao.  Nhu cầu tìm hiểu các phƣơng pháp nuôi cấy tế bào tối ƣu nhất. Lịch sử hình thành Từ khi nào chúng ta đã biết có công nghệ nuôi cấy tế bào? Công nghệ nuôi cấy tế bào ngày nay khác với công nghệ nuôi cấy tế bào ngày xa xƣa nhƣ thế nào? Mục đích của nuôi cấy tế bào hiện đại? 10 11/27/2013 Lịch sử hình thành “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay “Tế bào là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc sinh vật” (Schleiden và Schwann, 1838). Lịch sử hình thành Sydney Ringer (1836 – 1910), ngƣời Anh khám phá ra dung dịch Ringer’s Solution quyết định nồng độ ƣu trƣơng từ các loại muối gồm 6.5g NaCl, 0.42g KCl, 0.25g CaCl2 and 1 mole Natri bicarbonate Ứng dụng trong tất cả các thí nghiệm in vitro về các mô và cơ quan (cơ, tim của chim, cá, động vật có vú..) Lịch sử hình thành Wilhelm Roux (1850 – 1924) ngƣời Đức Vào năm 1885, Roux chuyển 1 mẫu đĩa môi trƣờng nuôi cấy tế bào thần kinh of 1 phôi tế bào gà và duy trì trong 1 môi trƣờng muối saline, mở đầu cho việc phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào. 11 11/27/2013 Lịch sử hình thành • Từ 1907–1910, sáng chế ra mô tế bào nhân tạo từ tế bào thần kinh ếch trong môi trƣờng chứa lymphocytes Ross Granville Harrison (Mỹ) (1870 – 1959) Lịch sử hình thành • Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những tác giả đầu tiên tách và nuôi cấy thành công tế bào đơn của thực vật trong các bình lên men ở môi trƣờng nhân tạo. Mục đích tìm hiểu • Các chất xúc tác sinh học và tế bào đƣợc chọn lọc hoặc sửa đổi di truyền phải thích hợp cho các hoạt động sản xuất • Phù hợp với mô hình sản xuất quy mô công nghiệp ứng dụng • Tìm hiểu các phƣơng pháp tối ƣu nhất cho nhu cầu thu nhận sinh khối 1 sản phẩm thƣơng mại 12 11/27/2013 Các quá trình sinh học (Bio-processing) – Phải thu đƣợc các chất xúc tác sinh học tốt nhất (vi sinh vật, tế bào động vật, tế bào thực vật,hoặc enzyme) – Tạo ra môi trƣờng tốt nhất có thể cho sự xúc tác bằng cách thiết kế các bioreactor/fermenter thích hợp với phƣơng thức tối ƣu nhất. – Phân tách các sản phẩm mong muốn từ hỗn hợp phản ứng trong một phƣơng thức kinh tế nhất. NHẮC LẠI Bio-prossessing Kỹ thuật tạo dòng tế bào 13 11/27/2013 Bể phản ứng sinh học Bể phản ứng sinh học Theo anh/chị, bể phản ứng sinh học (Bioreactor) là gì? Mục đích của việc sử dụng bể phản ứng sinh học là gì? 14 11/27/2013 27/11/2013 43 27/11/2013 44 27/11/2013 45 15 11/27/2013 27/11/2013 46 27/11/2013 47 27/11/2013 48 16 11/27/2013 27/11/2013 49 27/11/2013 50 27/11/2013 51 17 11/27/2013 Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là chọn lọc các tế bào ở giai đoạn phát triển tối ƣu nhất trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của tế bào sinh vật sống gồm 4 giai đoạn là: thích nghi, tăng trƣởng, cân bằng và suy tàn. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào • Điểm khác biệt giữa phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn thực vật và động vật, VSV ở: – Mức độ vô trùng – Tồn tại dƣới dạng huyền phù – Tốc độ phân chia  sinh khối – Phƣơng thức sinh dƣỡng – Các chất đƣợc tạo ra trong quá trình trao đổi chất – Cấu trúc cơ thể sinh vật Các dạng nuôi cấy tế bào 18 11/27/2013 Nuôi cấy tế bào vi sinh vật  Prokaryotes:  Tế bào vi khuẩn  Virus và các bacteriophage  VSV Eukaryotes: nấm men, nấm mốc, tảo (algae), ĐV nguyên sinh (protozoa) Sơ lược về lịch sử phát hiện và giới thiệu kháng sinh penicillin Phát hiện tình cờ vào năm 1928 do A. Fleming Kháng sinh penicillin Penicillin chrysogenum • Thuộc họ hiếu khí bắt buộc, • Là loại nấm sợi bào tử hở. • Khi mới phát hiện trong môi trường đặc, chúng tạo ra hai dạng khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng màu trắng 19 11/27/2013 Dựa vào tính chất của canh trường Nuôi cấy chìm Nuôi bề mặt Hiệu quả kinh tế • Với nguồn cơ chất chính là glucose và lên men theo phương pháp chìm • Nồng độ penicillin G trong dịch lên men những năm 80 - 90 của thế kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng năng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/m3 dịch lên men ). 20