Tài liệu Bài 5

Bài 5: Sư chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitơ nhờ VSV I. Quá trình amon hóa protein (Lên men thối) 1. Bản chất: Protein - - protease do VSV ti ế t ra → polypeptide, aa Tổng hợp pr cho cơ thể VSV NH3, H2S, CO2, sản phẩm trung gian Nhiệt độ tối ưu: 25 – 30oC Sản phẩm cuối cùng: + Điều kiện thoáng khí: NH3, H2S, CO2, H2O + Điều kiện kị khí: tích lũy nhiều sản phẩm trung gian như indol, skatol, cadaverin, acmatin, histamin. 2. VSV phân giải: Rất nhiều loài tham gia quá trình amon hóa trong tự nhiên, chủ yếu là các loài: + Vi khuẩn: Bacillus (B. mycoides, B. subtilis, B. cereus, B. mesentericus,…); Pseudomonas (P. aeruginosa, P.fluorescens,…); Clostridium (C. putrificum, C. sporogenes,…); E.coli; Proteus vulgaris. + Xạ khuẩn: Steptomyces (S. griseus, S. rimosus,…) + Nấm mốc: Aspegillus (A. flavus, A. niger, A. oryzae,…) 3. Đặt thí nghiệm: - Chuẩn bị 6 bình tam giác, mỗi bình cho khoảng 5 – 6 hạt thịt cắt hạt lựu + 30ml nước + Bình 1: Không đun + Bình 2: Đun sôi + Bình 3: thêm 1 viên đất cỡ hạt thịt, không đun + Bình 4: thêm 1 viên đất cỡ hạt thịt, đun sôi + Bình 5: thêm 6g đường + Bình 6: thêm 6g đường + NaCl - Để trên miệng mỗi bình 3 mẩu giấy chỉ thị: + Quỳ hồng và dải giấy tẩm Nesler để xác định sự có mặt của NH 3 + Dải giấy tẩm chì acetate10% để xác định sự có mặt của H 2S - Làm nút bông hiếu khí. Ủ ở 28 – 35oC trong 4 – 7 ngày. 4. Kết quả:  Quan sát bình lên men: Khí bay lên TN Dịch lên men Miếng thịt Quỳ Nesler (NH3) (NH3) Chì acetate (H2S) Mùi Quan sát VSV Bình 1 Màu vàng nhạt, đục, có váng trên bề mặt Trương, mủn ít (+) Bình Trong, không màu, Không trương, 2 Bình không váng Xanh rêu nhạt, đục, không mủn (-) Trương, mủn ít 3 Bình có váng Đen, hơi xanh, có ít (+) Mủn nhiều (++ 4 váng Vàng, đục, sánh đặc +) Bình 5 mốc trên bề mặt dung Bình 6 như thạch, có nấm dịch Dịch hơi vàng, vẩn ít, ít váng Xanh Vàng Xanh Vàng Đen Xanh Vàng Đen Xanh Vàng Đen Không Không +) màu màu Không Không đổi đổi màu màu trung bình (++) Hơi thối (+) Nhóm 1, 2, 3 Mủn hết (+++ Trương, mủn Đen Hơi đen Không đổi màu Thối (++) Rất thối (++ quan sát VSV ở bình 3 +) Rất thối (++ ++) Mùi hơi chua Nhóm 4, 5, 6 quan sát VSV ở bình 4 Không mùi    Xác định sự có mặt của NH 4 trong dung dịch: - Nhỏ vào bản sứ: 1 giọt dịch lên men + 1 giọt Nesler Kết quả: Kết quả là 5 bình 1,2,3,4,5 dd đều chuyển màu vàng cam (bình 5 màu vàng rất nhạt) nhưng theo kq thử màu bằng quỳ thì không có NH3 nên chú thống nhất lại với mấy nhóm khác nhé. Bình 6 không chuyển màu.  Quan sát VSV ở bình 4: - Làm tiêu bản cố định nhuộm đơn fucshin II. - - Quá trình amon hóa Ure: 1. Bản chất: Quá trình phân giải ure diễn ra dưới sự xúc tác của urease của VSV: CO(NH2)2 + 2H2O → (NH4)2CO3 (ít bền vững, phân giải tiếp) (NH4)2CO3 → NH3 + CO3 + H2O 2. VSV phân giải Ure: Thường là vi khuẩn hiếu khí, số ít là kị khí, sinh trường manh ở pH trung tính hoặc hơi kiềm (pH = 7 – 8) + Cầu khuẩn: Planosarcina ureae, Micrococcus ureae, Sarcina hansenii + Trực khuẩn: Bacillus (B. pasteurii, B. freidereichii, B. hesmogenes…); - Pseudobacterium ureoliticum; Chromobacterium prodigiosum; Proteus vulgaris… + Nấm mốc, xạ khuẩn. 3. Đặt thí nghiệm: Cho môi trường Zenghen vào ống nghiệm (khoảng ½ ống). Thêm vào 1 viên đất cỡ hạt - lựu. Để 3 dải giấy (quỳ hồng, dải giấy tẩm Nesler, dải giấy tẩm chì acetate) trên miệng ống nghiệm. Làm nút bông hiếu khí. Ủ ở 25 – 30oC trong 3 – 5 ngày. 4. Kết quả:  Quan sát ống nghiệm lên men: - Dịch lên men: màu vàng nâu, hơi xỉn, trong. - Màu dải giấy: Quỳ (màu xanh); Giấy tẩm Nesler (màu vàng); Giấy tẩm chì acetate - (không đổi màu) Mùi: hơi khai. ð Có khí NH3 tạo thành, không có H2S.    Xác định sự có mặt của NH 4 trong dung dịch: - Nhở lên bản sứ: 1 giọt dịch lên men + 1 giọt Nesler - Kết quả: hình như cái này các nhóm không làm. Chú hỏi lại nhé.  Quan sát VSV III. Quá trình nitrat hóa: 1. Bản chất:  - −   NH3 hoặc NH 4 trong điều kiện hiếu khí chuyển hóa thành NO 3 theo 2 giai đoạn:  Giai đoạn nitrit hóa: 2NH3 + 3O2 → 2HNO2 + 2H2O + 275kJ -  Giai đoạn nitrat hóa: 2HNO2 + 3O2 → 2HNO3 + 75kJ 2. VSV tham gia: Giai đoạn nitrit hóa do nhóm VK: Nitrosomonas Giai đoạn nitrat hóa do nhóm VK: Nitrobacter 3. Đặt thí nghiệm: Lấy 3ml môi trường Nitrit hóa I vào ống nghiệm 1 (Ống N1) Lấy 3ml môi trường Nitrit hóa II vào ống nghiệm 2 (Ống N2) Thêm 1 viên đất (cỡ hạt lựu) vào mỗi ống nghiệm. Làm nút bông hiếu khí. Ủ ở 28 – 30oC trong 5 – 7 ngày. 4. Kết quả:  Định tính: - Giai đoạn Nitrit hóa (Sử dụng ống N1)  Phản ứng với dung dịch Trommsdorf: o Dùng pipet lấy lên bản sứ: 3 giọt Trommsdorf + 1 giọt H 2SO4 33% + 1 giọt dịch nuôi cấy. Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. o Kết quả: Dung dịch chuyển màu đen (Do có − NO 2 )  Phản ứng tạo màu với dung dịch Griss I + II: o Dùng pipet lấy lên bản sứ: 1 – 2 giọt dịch nuôi cấy + 1 giọt Griss I + 1 giọt Griss II. − o Kết quả: Dung dịch chuyển màu đỏ pháo (Do có NO 2 ) - Giai đoạn Nitrat hóa (Sử dụng ống N2)  Phản ứng với dung dịch Trommsdorf: o Dùng pipet lấy lên bản sứ: 3 giọt Trommsdorf + 1 giọt H2SO4 33% + 1 giọt dịch nuôi cấy. Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. o Kết quả: Dung dịch không màu.  Phản ứng tạo màu với dung dịch Griss I + II: o Dùng pipet lấy lên bản sứ: 1 – 2 giọt dịch nuôi cấy + 1 giọt Griss I + 1 giọt Griss II. o Kết quả: Dung dịch không màu.  Quan sát VSV: IV. Quá trình phản Nitrat hóa: 1. Bản chất: NH2OH − NO 3 → − NO 2 → → NH3 ↑ NO N 2O → N2 ↑ 2. VSV tham gia: Thường là VK kị khí không bắt buộc. Bao gồm nhiều loài trong các giống: + Pseudomonas (hình gậy, gram âm, không sinh bào tử, có tiên mao ở đỉnh): P. - fluorescens, P. denitrificans, P. aeruginosa,… + Bacterium (B. denitrificans, Achromobacter stutzeri); Bacillus licheniformis… 3. Đặt thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm:10 – 15ml môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat + 1 viên đất - (cỡ hạt lựu). Làm nút bông kị khí. Dùng túi nilong và dây chun bọc kín miệng ống nghiệm. Ủ ở 30 – 35oC trong 5 – 6 ngày. 4. Kết quả:  Định tính:   Xác định sự có mặt của NH 4 : - + Nhỏ vào bản sứ: 1 giọt dịch lên men + 1 giọt Nesler + Kết quả: Dung dịch chuyển từ vàng nhạt sang vàng sẫm - Kiểm tra dung dịch có tạo thành − NO 2 hay không: + Nhỏ lên bản sứ: 1 – 2 giọt dịch nuôi cấy + 1 giọt GrissI + 1 giọt GrissII + Kết quả: dung dịch chuyển màu đỏ pháo ð Có tạo thành − NO 2  Quan sát VSV: - Làm tiêu bản nhuộm đơn