Bé y tÕ
ViÖn dinh d−ìng
B¸o c¸o ®Ò tµi
¸p dông ph−¬ng ph¸p Elisa ph¸t hiÖn ®éc tè
LT cña c¸c chñng Escherichia coli ph©n l©p
trong thùc phÈm
C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi:
ViÖn Dinh D−ìng
Chñ nhiÖm ®Ò tµi:
BS. Ph¹m ThÞ Thanh YÕn
5751
05/4/2006
Hµ Néi - 2005
1
Bé y tÕ
ViÖn dinh d−ìng
B¸o c¸o ®Ò tµi
¸p dông ph−¬ng ph¸p Elisa ph¸t hiÖn ®éc tè
LT cña c¸c chñng Escherichia coli ph©n l©p
trong thùc phÈm
Chñ nhiÖm ®Ò tµi:
BS. Ph¹m ThÞ Thanh YÕn
C¸n bé thùc hiÖn:
Ph¹m ThÞ Thanh YÕn
NguyÔn Lan Ph−¬ng
NguyÔn ¸nh TuyÕt
Hµ ThÞ Anh §µo
Hµ Néi - 2005
2
I. §Æt vÊn ®Ò:
Tiªu ch¶y lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n hµng ®Çu g©y tö vong ë trÎ em
®Æc biÖt lµ ë c¸c n−íc vïng nhiÖt ®íi, trong ®ã Escherichia coli (E.coli) lµ mét
trong nh÷ng nguyªn nh©n g©y tiªu ch¶y cÊp ë trÎ em . E.coli g©y tiªu ch¶y
®−îc chia lµm 5 lo¹i, bao gåm (1):
• E.coli g©y bÖnh (Enteropathogenic E. coli, viÕt t¾t lµ EPEC)
• E.coli sinh ®éc tè ruét (Enterotoxigenic E. coli, viÕt t¾t lµ ETEC)
• E.coli x©m nhËp (Enteroinvasive E.coli, viÕt t¾t lµ EIEC)
• E.coli g©y ch¶y m¸u (Enterohemorrhage E.coli, viÕt t¾t lµ EHEC)
• E.coli b¸m dÝnh (Enteroaggregative E.coli, viÕt t¾t lµ EAggEC)
E.coli sinh ®éc tè ruét (ETEC) lµ chñng vi khuÈn sinh ®éc tè ruét trong
ruét non cña ng−êi vµ sóc vËt g©y Øa ch¶y mÊt n−íc gièng t¶. Cã 2 lo¹i ®éc tè
ruét: ®éc tè chÞu nhiÖt ST (Stable Toxin) bÞ ph¸ hñy ë 1000C trong 15 phót vµ
®éc tè kh«ng chÞu nhiÖt LT (Labile Toxin) dÔ bÞ ph¸ hñy ë 600C trong 15
phót. Cã chñng E.coli cã c¶ 2 lo¹i ®éc tè LT vµ ST, nh−ng còng cã chñng chØ
cã LT hoÆc ST(2).
LT lµ ph©n tö lín oligomer, cã cÊu tróc vµ chøc n¨ng gièng ®éc tè t¶ (CT –
cholera toxin), v× vËy c¬ chÕg©y bÖnh cña ETEC t−¬ng tù nh− bÖnh t¶. LT gåm
2 nhãm chÝnh : LT1 vµ LT2. §éc tè LT1 g©y bÖnh ë ng−êi vµ ®éng vËt. LT2
chØ g©y bÖnh ë ®éng vËt, hiÕm khi g©y bÖnh ë ng−êi.LT cã tÝnh kh¸ng nguyªn
(lµ kh¸ng nguyªn l«ng)
nªn cã vai trß quan träng trong nghiªn cøu v¨cxin phßng bÖnh.ST cã cÊu tróc
ph©n tö nhá, kh«ng cã tÝnh kh¸ng nguyªn nªn Ýt ®−îc nghiªn cøu h¬n. §éc tè
ST gåm 2 lo¹i: Sta vµ STb.
E.coli sinh ®éc tè lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n g©y tiªu ch¶y ë trÎ em
c¸c n−íc ®ang ph¸t triÓn. Mét sè nghiªn cøu cho thÊy kho¶ng 10 - 30% c¸c
3
tr−êng hîp tiªu ch¶y ë trÎ em lµ do E.coli sinh ®éc tè. C¸c ®iÒu tra dÞch tÔ cho
thÊy: thùc phÈm vµ n−íc ë vïng cã dÞch tiªu ch¶y tû lÖ nhiÔm ETEC rÊt cao,
hÇu hÕt trÎ em nu«i bé ( sau khi cai s÷a ) ë nh÷ng vïng nµy bÞ nhiÔm ETEC
qua thøc ¨n. §iÒu kiÖn khÝ hËu nãng Èm, ®Æc biÖt vµo mïa hÌ lµ mét trong
nh÷ng ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho sù ph¸t triÓn cña ETEC trong thùc phÈm vµ
n−íc. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y ®Ó ph¸t hiÖn ®éc tè cña E.coli cã nhiÒu kü
thuËt ®−îc ¸p dông nh−: kü thuËt ELISA, ng−ng kÕt (latex aglutination) vµ
ph¶n øng chuçi men (PCR) (3, 4).
E.coli lµ mét trong nh÷ng chØ tiªu quan träng ®Ó ®¸nh gi¸ møc ®é « nhiÔm
cña c¸c lo¹i thùc phÈm. Theo sè liÖu nghiªn cøu, kh¶o s¸t cña Phßng thÝ
nghiÖm Vi sinh - ViÖn Dinh d−ìng cho thÊy: tû lÖ nhiÔm E.coli chiÕm kho¶ng
15 - 25% trong tæng sè c¸c mÉu thùc phÈm cã nguy c¬ (5). Do vËy, viÖc x¸c
®Þnh E.coli trong c¸c mÉu thùc phÈm cã kh¶ n¨ng sinh ®éc tè g©y tiªu ch¶y
®ãng vai trß quan träng trong c«ng t¸c gi¸m s¸t VSATTP mét c¸ch cã hiÖu
qu¶. Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i ¸p dông kü thuËt ELISA ®Ó x¸c ®Þnh ®éc
tè LT cña c¸c chñng E.coli ph©n lËp ®−îc trong thùc phÈm n¨m, 2004 do
ph−¬ng ph¸p nµy cã ®é nh¹y vµ ®é ®Æc hiÖu cao.
II. Môc tiªu ®Ò tµi
TriÓn khai kü thuËt ELISA ph¸t hiÖn ®éc tè LT cña c¸c chñng E.coli
ph©n lËp trong thùc phÈm.
III. §èi t−îng, thêi gian vµ kü thuËt ¸p dông
1. §èi t−îng:
- MÉu thùc phÈm: tæng sè 80 mÉu, trong ®ã:
+ 60 mÉu lßng lîn ch−a qua chÕ biÕn
+ 10 mÉu lßng lîn ®· qua chÕ biÕn
+ 10 mÉu tiÕt canh
- §Þa ®iÓm lÊy mÉu: chî Ngäc Hµ (quËn Ba §×nh), chî CÇu GiÊy (quËn
CÇu GiÊy), chî Thanh Xu©n (quËn Thanh Xu©n).
4
- C¸ch lÊy mÉu: c¸c mÉu lßng lîn ( lßng giµ, non) vµ tiÕt canh ®−îc mua
vµo buæi s¸ng tõ 10 ®Õn 11 giê. Mçi mÉu lÊy tèi thiÓu lµ 250g, ®ùng vµo tói
polyetylen v« trïng, råi ®−a ngay vÒ phßng thÝ nghiÖm ®Ó kiÓm tra trong
vßng kh«ng qu¸ 3 giê.
2. Thêi gian tiÕn hµnh ®Ò tµi:
- Ph©n lËp c¸c chñng E.coli tõ thùc phÈm: 7 – 27 th¸ng 12 n¨m 2004
- TriÓn khai kü thuËt ELISA
: 3 – 27 th¸ng 5 n¨m 2005
3. Kü thuËt ¸p dông:
- Kü thuËt x¸c ®Þnh E.coli trong thùc phÈm theo TCVN5159 – 1990 ®Ó
ph©n lËp c¸c chñng E.coli.
- Kü thuËt ELISA x¸c ®Þnh ®éc tè LT cña c¸c chñng E.coli (1).
IV. Néi dung vµ kÕt qu¶ triÓn khai
A. KÕt qu¶ ph©n lËp E.coli trong thùc phÈm:
Tªn chî
Thùc phÈm
Sè mÉu kiÓm tra
Sè mÉu nhiÔm
Chî Ngäc Hµ
Lßng non
1
1
Lßng giµ
1
1
TiÕt canh
4
2
Lßng non
2
1
Lßng giµ
3
3
TiÕt canh
2
1
Lßng non
3
3
Lßng giµ
4
4
20
16
Chî CÇu GiÊy
Chî Thanh Xu©n
Céng
Qua kiÓm tra 20 mÉu lßng lîn sèng, tiÕt canh t¹i 3 chî: Ngäc Hµ, CÇu
GiÊy, Thanh Xu©n chóng t«i ®· thu thËp ®−îc 16 chñng E.coli.
5
B. TiÓn khai kü thuËt ELISA
1. Nguyªn lý
+
GM1
LT
KT1
KT2 – Enzym
C¬ chÊt
ELISA ( Enzyme- Linked Immunosorbent assay ) lµ ph¶n øng miÔn dÞch gi÷a
kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ cã g¾n men.
- GM1 cã vai trß thô thÓ b¸m diÝnh ®éc tè LT.
KT1 (kh¸ng thÓ 1) : lµ huyÕt thanh thá kh¸ng ®éc tè LT.
- KT2 (kh¸ng thÓ 2) : Lµ huyÕt thanh dª ( Ig G dª kh¸ng thá ) cã g¾n enzym
( th−êng gäi lµ céng hîp men ).
- Khi x¶y ra sù kÕt hîp gi÷a LT vµ KT1, th× c¬ chÊt gióp ®o ®−îc ho¹t ®éng
cña enzym, tõ ®ã x¸c ®Þnh ®−îc sè l−îng KT1 g¾n vµo LT, qua ®ã x¸c ®Þnh
®−îc LT.
2. VËt liÖu, ho¸ chÊt, m«i tr−êng
- Canh thang BRILA ( Merck )
- Th¹ch ENDO ( Merck )
- Th¹ch Citrat Simmons ( Merck )
- Pastone ( Sanofi )
- M«i tr−êng canh thang trypticase soy (Merck)
- GM1 (Monosialoganglioside - Sigma )
- HuyÕt thanh thá kh¸ng ®éc tè LT ( Sigma )
6
- Céng hîp men: HuyÕt thanh dª g¾n víi men phophatase kiÒm (Goat
Antihuman IgG - Alkaline phosphatase conjugate - Sigma)
- C¬ chÊt : OPD (O-Phenylenediamine dihydrochloride tablet-Sigma)
- Phosphate Buffered Saline (PBS, pH 7,4)
- BSA (Bovine Serum Albumine - Sigma Fine Chemical)
- Khay nhùa 96 giÕng ®¸y b»ng (Nunc - 439454); pi pet vµ ®Çu tÝp
- M¸y ®äc ELISA (Biorad)
- Eppendorf
- èng Falcol
- M¸y l¾c Voltex
- M¸y ly t©m
3. Chñng thö nghiÖm
- Chøng d−¬ng: ETEC EBa-35 (NhËt B¶n)
- Chøng ©m: STEC O111-19 (NhËt B¶n)
- C¸c chñng E.coli ph©n lËp tõ c¸c mÉu thùc phÈm
4. ChuÈn bÞ dÞch næi chñng E.coli ®∙ ph©n lËp ®−îc vµ c¸c chñng chøng
d−¬ng, chøng ©m:
16 chñng E.coli ®· ph©n lËp vµ chñng ETEC EBa-35 (chøng d−¬ng) vµ
chñng STEC O111-19 (chøng ©m) ®−îc nu«i cÊy trong canh thang Trypcase
soy (9ml canh thang/èng), ñ Êm 37oC/18 giê. Sau ®ã cho vµo èng ly t©m ( 4 ml
canh trïng/èng), råi ly t©m 2000 vßng/phót trong 5 phót, lÊy dÞch næi.
5. ChuÈn bÞ c¸c dung dÞch ®Öm:
+ Dung dÞch mÑ
Na2HPO4
5,48g
Na2H2PO4.H2O
1,575g
N−íc cÊt
100ml
pH = 7,2
+ R1-§Öm phñ ®Üa
7
Dung dÞch mÑ
20ml
NaCl
9g
N−íc cÊt
1000ml
pH = 7,2
+ R2-§Öm röa
NaCl
8,5g
Tween 20
1ml
NaN3
0,2g
N−íc cÊt
1000ml
+ R3-§Öm kho¸
R1
10ml
BSA
0,1g
+ R4-§Öm pha kh¸ng thÓ:
R1
10ml
BSA
0,1g
Tween 20
10µl
+ R5-§Öm pha c¬ chÊt
Tris base
1,21g
MgCl2
30µl
N−íc cÊt
8ml
ChØnh pH = 9,8 b»ng HCl sau ®ã thªm n−íc cÊt cho ®ñ 10ml
+ Dung dÞch dõng ph¶n øng (NaOH 3M)
NaOH
12g
N−íc cÊt
100ml
6. Pha c¸c sinh phÈm
20 µl GM1 + 3980 µl R1
- Pha GM1 (nång ®é 5µg/ml):
- Pha huyÕt thanh thá kh¸ng ®éc tè LT tû lÖ 1/1000 (Kh¸ng thÓ 1 - KT1)
4µl KT1 + 4000 µl R4
8
- Pha IgG dª kh¸ng thá cã g¾n enzyme tû lÖ 1/1000 ( Kh¸ng thÓ 2 hay cßn gäi
lµ céng hîp men – KT 2)
4µl KT2 + 4000 µl R4
- Pha Subtrate:
1 viªn OPD + 20 ml R5
7. TiÕn hµnh ELISA
Chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm víi mÉu chøng d−¬ng, chøng ©m vµ16
chñng E.coli ph©n lËp ®−îc. ThÝ nghiÖm bè trÝ theo s¬ ®å sau:
1
A
B
C
D
E
F
G
H
PC
PC
NC
NC
2
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
3
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
4
M9
M10
M11
M12
M13
M14
M15
M16
5
M9
M10
M11
M12
M13
M14
M15
M16
6
7
8
9
10
11
Trong ®ã:
PC: ®èi chøng d−¬ng (Positive control)
NC: ®èi chøng ©m (Negative control)
* C¸c b−íc tiÕn hµnh:
- B−íc 1: G¾n b¶n GM1 : 100µl/giÕng, råi ®Ó qua ®ªm ë nhiÖt ®é phßng.
- Bø¬c 2: Röa b¶n 3 lÇn víi R2: 200 µl/giÕng trong 3 phót.
- B−íc 3: Cho R3: 100µl/giÕng, ñ 1 giê ë 37oC.
- B−íc 4: Röa b¶n 3 lÇn víi R2: 200 µl/giÕng trong 3 phót.
- B−íc 5: Cho dÞch næi chñng chøng d−¬ng, chñng chøng ©m vµ E.coli cÇn
kiÓm tra ®éc tè, mçi mÉu 2 giÕng : 100µl /giÕng ñ 2 giê ë 370C.
- B−íc 6:Röa b¶n 3 lÇn víi R2: 200 µl/giÕng trong 3 phót.
- B−íc 7: Cho kh¸ng thÓ1: 100µl/giÕng ñ 1 giê ë 370C.
9
12
- B−íc 8: Röa b¶n 3 lÇn víi R2: 200 µl/giÕng trong 3 phót
- B−íc 9: Cho kh¸ng thÓ 2: 100µl/giÕng ñ 1 giê ë 37oC.
- B−íc 10: Röa b¶n 3 lÇn víi PBS -Tween 20: 200 µl/giÕng trong 3 phót.
- B−íc 11: Cho c¬ chÊt: 100µl /giÕng ñ 50 phót ë 37oC
- B−íc 12: Lµm ngõng ph¶n øng b»ng NaOH3M: 50µl/giÕng, ®Ó ë nhiÖt ®é
phßng thÝ nghiÖm cho tíi khi chøng d−¬ng cã mµu vµng râ, (thêi gian chê
kh«ng qu¸ 15 phót).
IV. KÕt qu¶ ELISA
§äc kÕt qu¶ b»ng m¸y ®äc ELISA ë b−íc sãng 405nm. HiÖu gi¸ mÉu
thö nghiÖm cao h¬n chøng ©m gÊp 2 lÇn trë lªn th× ®−îc coi lµ d−¬ng tÝnh.
Khi quan s¸t b»ng m¾t x¸c ®Þnh ph¶n øng d−¬ng tÝnh nhê sù xuÊt hiÖn
mµu vµng trong giÕng thÝ nghiÖm, thÓ hiÖn sù t−¬ng t¸c gi÷a ®éc tè trong dÞch
næi cña vi khuÈn E.coli (LT) vµ kh¸ng thÓ kh¸ng ®éc tè cña thá. KÕt qu¶
ELISA cho thÊy, mµu vµng xuÊt hiÖn ë vÞ trÝ mÉu sè 6 (F2, F3) vµ mÉu sè 14
(F4, F5) t−¬ng tù nh− mµu ë giÕng ®èi chøng d−¬ng (E1, F1), cßn mÉu chøng
©m vµ c¸c mÉu cßn l¹i ®Òu kh«ng cã mµu, chøng tá ph¶n øng kh«ng x¶y ra,
hay nãi c¸ch kh¸c lµ trong dÞch næi kh«ng cã ®éc tè LT (xem h×nh 1).
H×nh 1: Ph¶n øng mµu ELISA
10
§Üa ELISA sau khi ®· dõng ph¶n øng ®−îc cho vµo m¸y ®äc ë b−íc sãng
405 nm vµ cã kÕt qu¶ nh− b¶ng sau (xem b¶ng 2:
B¶ng 2: KÕt qña Elisa
1
2
3
4
5
A
0.052 0.045 0.153 0.157
B
0.056 0.052 0.166 0.161
C
0.158 0.171 0.172 0.170
D
0.053 0.056 0.170 0.167
E
1.825 0.052 0.049 0.160 0.165
F
1.877 1.540 1.566 1.61
G
0.164 0.058 0.135 0.008 0.005
H
0.158 0.155 0.179 0.006 0.007
6
7
8
9
10 11 12
1.70
Nh×n vµo b¶ng kÕt qu¶ chóng t«i thÊy gi¸ trÞ OD trung b×nh cña mÉu sè
6 vµ sè 14 lÇn l−ît lµ 1.553 vµ 1.655 lµ t−¬ng ®èi cao, gÇn b»ng gi¸ trÞ trung
b×nh cña mÉu d−¬ng chuÈn (1.851), cao h¬n chøng ©m gÊp 9,6 lÇn (mÉu sè 6)
vµ 10,3 lÇn (mÉu sè 14), tøc lµ gi¸ trÞ OD cña mÉu sè 6 vµ sè 14 cao h¬n chøng
©m >2 lÇn ®−îc coi lµ d−¬ng tÝnh (cã ®éc tè LT). VËy trong tæng sè 16 chñng
E.coli ph©n lËp ®−îc tõ c¸c mÉu lßng lîn sèng vµ tiÕt canh, th× chØ cã 2 chñng
cã ®éc tè lµ mÉu sè 6 vµ mÉu sè 14.
KÕt qu¶ Elisa ®−îc thÓ hiÖn th«ng qua biÓu ®å 1
11
M
15
Sè thø tù mÉu
M
13
M
11
M
9
M
7
M
5
M
3
M
1
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
PC
Gi¸ trÞ OD
BiÓu ®å 1: KÕt qu¶ Elisa cña c¸c chñng E.coli
V. KÕt luËn:
Qua kÕt qu¶ triÓn khai ®Ò tµi, chóng t«i ®· triÓn khai thµnh c«ng kü
thuËt ELISA ph¸t hiÖn ®äc tè LT cña c¸c chñng Escheria coli ph©n lËp trong
thùc phÈm.
12
Tµi liÖu tham kh¶o
1. Hoµng Thu Thuû. Ph−¬ng ph¸p kü thuËt ph¸t hiÖn ®éc tè ruét cña
Escherichia coli. Kü thuËt xÐtnghiÖm Vi sinh vËt Y häc-Nhµ xuÊt b¶n
v¨n ho¸ Hµ néi 1991: tr: 91-94.
2. Nh÷ng nghiÖm ph¸p chuÈn ®o¸n E. coli sinh ®éc tè ruét. Sæ tay xÐt
nghiÖm vÒ nhiÔm khuÈn ®−êng ruét cÊp tÝnh.Tµi liÖu dÞch tõ CDD/83.3
cña OMS: tr: 40-60.
3. Black,R.E.M.H. Brown, S. Becker, and M.H.Merson. Contamination of
weaning foods and transmission of Enterotoxigenic Eschirichia
diarrhoer in children in rural Bangladesh. 1982;
Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 76: 259-64.
4. Black,R.E,M.H. Merrson, B. Rowe, P. R, Taylor, and D .A Sack.
Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoer: acquired imnunity and
transmission in an endemic area. Bull. WHO1981; 59: 263-68.
5 Hµ ThÞ Anh §µo, Ph¹m Thanh YÕn, NguyÔn Lan Ph−¬ng. Thùc tr¹ng
ATTP
thøc ¨n chÕ biÕn s½n trªn ®Þa bµn Hµ Néi n¨m 2002; Héi nghÞ
khoa häc ATVSTP 2003 tr: 99-104.
6 Yolken RH, greenberg HB, Merson MH, Sack RB, Kapikian AZ.
Enzyme--linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli
heat-labile enterotoxin. . J Clin Microbiol 1977; 6: 439-44.
13
- Xem thêm -
.PDF 
13 
262 
112 
