Tài liệu Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng bacterial cellulose của vi khuẩn gluconacetobacter

MỤC LỤC MỞ ĐẦU..............................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài...........................................................................................................1 2. Mục đích nghiên cứu ....................................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...............................................................................2 5. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................................3 6. Điểm mới của đề tài ......................................................................................................3 NỘI DUNG..........................................................................................................................4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................4 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter ......................4 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter ...........................................5 1.3. Bacterial cellulose (BC)...........................................................................................5 1.3.1. Cấu trúc ..............................................................................................................5 1.3.2. Một số tính chất của màng BC .........................................................................6 1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter ...............................6 1.3.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter ...................8 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC .........................................9 1.4.1. Nguồn cacbon.....................................................................................................9 1.4.2. Nguồn nitơ ..........................................................................................................9 1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng .............................................................................10 1.4.4. Các chất kích thích sinh trưởng .....................................................................10 1.4.5. Điều kiện nuôi cấy ...........................................................................................11 1.4.5.1. Độ pH ........................................................................................................ 11 1.4.5.2. Nhiệt độ..................................................................................................... 11 1.4.5.3. Độ thông khí ............................................................................................. 11 1.4.5.4. Thời gian nuôi cấy ................................................................................... 11 1.4.5.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V) ............ 12 1.5. Ứng dụng của màng BC .......................................................................................12 1.5.1. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông...............................12 1.5.2. Ứng dụng trong y học......................................................................................13 1.5.3. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác .............................................13 1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay ..................................15 1.6.1. Trên thế giới .....................................................................................................15 1.6.2. Tại Việt Nam.....................................................................................................17 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................20 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................................20 2.1.1. Giống .................................................................................................................20 2.1.2. Thiết bị và hóa chất .........................................................................................20 2.1.2.1. Thiết bị ...................................................................................................... 20 2.1.2.2. Hóa chất .................................................................................................... 20 2.1.3. Môi trường ........................................................................................................21 2.1.3.1. Môi trường giữ giống (MT1) ................................................................. 21 2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) ............................................................... 21 2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3) .................................................................... 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................21 2.2.1. Phương pháp vi sinh........................................................................................21 2.2.1.1. Phân lập tuyển chọn chủng G. xylinus theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck).............................. 21 2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép ................................................................ 23 2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng ................................................................................................... 23 2.2.2. Phương pháp hóa sinh ....................................................................................23 2.2.2.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase .............................................. 23 2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic ....................................................................................................... 23 2.2.2.3. Xác định khả năng oxy hóa axit acetic ................................................. 24 2.2.2.4. Xác định khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton ...... 24 2.2.2.5. Xác định khả năng tổng hợp cellulose .................................................. 24 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter .......................................................................................25 2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường ..................... 25 2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ .......................... 25 2.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khoáng..................................................................................................... 25 2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC ..............................26 2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả ........................................................26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................27 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial cellulose trên một số nguồn nguyên liệu.......................................................27 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng BC ..........27 3.1.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu ..................................................................... 28 3.1.1.2. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng BC............................................................................................................ 28 3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC của một số chủng Gluconacetobacter .......................................................................................31 3.1.3. Tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng BC dai, mỏng ...........................34 3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới khả năng tạo màng BC từ chủng G. xylinus BHN2 .....................................................................................36 3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng G. xylinus ................................................................................36 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus .....................................................38 3.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO4 tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus................................................................40 3.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4.7H2O tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus .....................................................42 3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus ...........................................................................43 3.2.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa trong môi trường lên men tạo màng BC ...................................................................................................................45 3.2.7. Môi trường dinh dưỡng nước gạo thay thế nước dừa cho chủng G. xylinus BHN2 lên men tạo màng BC ..........................................................49 3.2.7.1. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo ......... 50 3.2.7.2. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa ........................................................................................................... 52 3.3. Khảo sát định hƣớng ứng dụng cho sản phẩm màng BC .............................53 3.3.1. Khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông ...............53 3.3.2. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông...............................54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................57 1. Kết luận .......................................................................................................................58 2. Kiến nghị .....................................................................................................................58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................60 DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter.............................................................................4 Hình 1.2. Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter .....7 Hình 1.3. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter.............8 Hình 1.4. Màng sinh học dễ bong, không gây đau rát trong điều trị bỏng .................19 Hình 3.1. Qui trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter ...........................................27 Hình 3.2. Một số mẫu màng BC thu được sau khi làm giàu nguyên liệu ..................28 Hình 3.3. Vòng phân giải CaCO3 ....................................................................................29 Hình 3.4. Chuyển hóa ethanol thành axit acetic của vi khuẩn acetic..........................30 Hình 3.5. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter .........................................................31 Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter khi nhuộm Gram ................32 Hình 3.7. Một số loại màng do các chủng vi khuẩn hình thành trên bề mặt môi trường dịch thể...................................................................................................33 Hình 3.8. Khả năng tạo cellulose của các chủng G. xylinus ........................................33 Hình 3.9. Hoạt tính catalase .............................................................................................34 Hình 3.10. Màng BC sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter ......................................35 Hình 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khối lượng tươi màng BC ........37 Hình 3.12. Ảnh hưởng hàm lượng (NH4 )2SO4 đến độ dày màng BC .........................39 Hình 3.13. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O tới độ dày màng BC ..............43 Hình 3.14.A. Quá trình lên men tĩnh...............................................................................47 Hình 3.14.B. Thu màng sau 5 ngày lên men ..................................................................47 Hình 3.15. Màng BC thu được sau 5 ngày lên men ......................................................48 Hình 3.16. Lên men tạo màng trên môi trường nước gạo ............................................50 Hình 3.17. Khối lượng màng BC thu được khi thay thế nước dừa bằng nước gạo ...51 Hình 3.18. Màng BC tươi của môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa ......................................................................................................52 Hình 3.19.A. Cà chua bọc bằng màng BC ....................................................................56 Hình 3.19.B. Cà chua hỏng sau 7 ngày .........................................................................56 Hình 3.20.A. Cà chua bọc túi nilông hỏng sau 12 ngày ............................................56 Hình 3.20.B. Cà chua bọc hỏng màng BC hỏng sau 23 ngày ....................................56 Hình 3.21.A. Roi hỏng sau 4 ngày .................................................................................56 Hình 3.21.B. Roi hỏng sau 12 ngày ...............................................................................56 Hình 3.22.A. Bảo quản dưa chuột ...................................................................................57 Hình 3.22.B. Dưa chuột hỏng sau 5 ngày.......................................................................57 Hình 3.23.A. Cam hỏng sau 12 ngày ..............................................................................57 Hình 3.23.B. Cà rốt hỏng sau 5 ngày ..............................................................................57 Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC ................9 Bảng 1.2. Ứng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau ...................14 Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng BC ........................................................................34 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến màng BC ......................................36 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của màng BC .......................................................................................................................38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khối lượng tươi của màng BC.40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khối lượng tươi của màng BC .......................................................................................................................42 Bảng 3.6. Khối lượng tươi của màng BC qua thời gian nuôi cấy ...............................44 Bảng 3.7. Thành phần hóa học của nước dừa già..........................................................45 Bảng 3.8. Thành phần vitamin có trong nước dừa ........................................................46 Bảng 3.9. Thành phần axit amin của nước dừa .............................................................46 Bảng 3.10. Khối lượng tươi màng BC ............................................................................47 Bảng 3.11. Thành phần dinh dưỡng có trong cám gạo .................................................50 Bảng 3.12. Khối lượng màng BC tươi khi lên men ở môi trường dinh dưỡng nước gạo thay thế nước dừa.......................................................................................51 Bảng 3.13. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa .....................52 Bảng 3.14. So sánh bảo quản cà chua bằng màng BC với túi ni lông thông thường và không bảo quản ............................................................................................53 Bảng 3.15. So sánh bảo quản một số loại quả bằng màng BC, túi ni lông và không bảo quản .............................................................................................................55 Biểu đồ 3.1. Mối tương quan giữa hàm lượng glucose và khối lượng màng BC......37 Biểu đồ 3.2. Mối tương quan giữa hàm lượng (NH4 )2SO4 và khối lượng màng BC 39 Biểu đồ 3.3. Mối tương quan giữa hàm lượng KH2PO4 và khối lượng màng BC.....41 Biểu đồ 3.4. Mối tương quan giữa hàm lượng MgSO4.7H2O và khối lượng màng BC .......................................................................................................................42 Biểu đồ 3.5. Khối lượng màng BC qua các thời gian nuôi cấy ...................................44 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới khối lượng màng BC ...................48 1 1. Lý do chọn đề tài MỞ ĐẦU Trong quá trình phát triển của lịch sử nhân loại, con người không ngừng tìm kiếm, nghiên cứu những nguồn nguyên liệu mới. Ngày nay, nhờ có sự phát triển mạnh mẽ như vũ bão của khoa học công nghệ mà việc nghiên cứu, tìm kiếm trở nên dễ dàng hơn. Các nhà khoa học đã phát hiện ra rất nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau và ứng dụng chúng trong thực tiễn cuộc sống. Một trong những nguồn nguyên liệu đã và đang được quan tâm gần đây đó là cellulose vi khuẩn hay Bacterial cellulose (BC). BC được cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) [17]. Khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, G. xylinus sẽ hình thành một lớp màng đó có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn. Màng BC do G. xylinus tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao; đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer lớn. Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin... đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo... [8]. Trên thế giới việc nghiên cứu G. xylinus và quá trình sinh tổng hợp BC cũng như ứng dụng của BC bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu đầu tiên là của Brown A.J và cộng sự năm (1886) [18]. Trải qua hơn 1 thế kỷ nhưng cho đến nay G. xylinus và màng BC vẫn đang thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, nghiên cứu về G. xylinus, màng BC 2 và ứng dụng của nó còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần đây. Các nghiên cứu và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên cứu hiện mới dừng ở nghiên cứu quá trình tạo màng BC ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng [20]. Nhằm bổ sung những hiểu biết về G. xylinus và quá trình tạo màng BC định hướng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng màng BC sau này, tôi lựa chọn đề tài: “Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khu hệ vi khuẩn Gluconacetobacter từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, nhằm bổ sung vào bộ sưu tập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng BC. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, sự đa dạng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng BC. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial cellulose trên một số nguồn nguyên liệu 3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng BC của vi khuẩn G. xylinus BHN2 3.3. Khảo sát định hướng ứng dụng cho sản phẩm màng BC 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 4.2. Phạm vi nghiên cứu: khả năng lên men tạo màng của các chủng Gluconacetobacter, ứng dụng trong thực tiễn 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp vi sinh 3 5.2. Phương pháp hóa sinh 5.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter 5.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC 5.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 6. Điểm mới của đề tài Đề tài tập trung thực hiện từ nuôi cấy, tuyển chọn, tìm môi trường dinh dưỡng nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn G. xylinus BHN2, đồng thời định hướng ứng dụng cho chủng nghiên cứu. 4 NỘI DUNG Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae. Họ này gồm 6 chi: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconobacter, Gluconacetobacter và Kozakia [20]. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ. Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, Gluconacetobacter dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt (tế bào có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh). Tế bào thường được tìm thấy nhiều trong dịch hoa quả, giấm, dịch rượu, trong đất…[17]. Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước nhỏ (đường kính khuẩn lạc đạt 1 - 2mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc 5 lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4 – 6. Vì Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ sung thêm axit acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [8]. Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của Gluconacetobacter bao gồm: oxy hóa ethanol thành axit acetic, CO2, H2O; phản ứng catalase dương tính; không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; chuyển hóa glucose thành axit; chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton; không sinh sắc tố nâu; tổng hợp cellulose [3]. 1.3. Bacterial cellulose (BC) 1.3.1. Cấu trúc BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC – plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopynanose. Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [17]. Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ mô ( microfibril) ( Jonas and Farah, 1998) [29], những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000) [40]. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1 - 9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy. 6 1.3.2. Một số tính chất của màng BC Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [18]. Một số tính chất của màng BC: Độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước. Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp, độ ẩm cao. 1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B 1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường thành các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [22]. Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào G. xylinus khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với axit béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose. 7 Hình 1.2. Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hòa ( hình 1.3). Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm [15]: 1PFK: Fructose-1-phosphate kinase. PGI: Phosphoglucoisomerase PGM: Phosphoglucomutase PTS: Hệ thống phosphotransferrase UGP:UDP-glucose pyrophosphorylase. Fru-bi-P:Fructose-1,6–bi-phosphate Fru-6-P: Fructose-6-phosphate. Glc-6-P: Glucose–6-phosphate. Glc-1-P: Glucose-1-phosphate. PGA: Phosphogluconic acid acid. UDPGlc: Uridine diphosphoglucose CS: Cellulose synthase. GK: glucokinase. FK: fructokinase. FBP: fructose -1,6 - biphosphate phosphatase. G6PDH: glucose – 6 - phosphate dehydrogenase. 8 Hình 1.3. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước các nhân tố có hại của môi trường. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi BC sống sót sau 1 giờ xử lý bằng tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [31]. Ngoài ra, màng BC còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. 9 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC 1.4.1. Nguồn cacbon Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những hợp chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC được thể hiện ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Nguồn cacbon Monosaccharide Năng suất tổng hợp cellulose Nguồn cacbon Disaccharide Năng suất tổng hợp cellulose D-Glucose 100 Lactose 16 D-Fructose 92 Maltose 7 D-Galactose 15 Sucrose 33 D-Xylose 11 Cellobiose D-Arabinos 14 D-Sorbose 11 7-11 1.4.2. Nguồn nitơ Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho cơ thể sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoaxit, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất [31]. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Do đó khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4 )2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men [31]. 10 1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng Phospho bao giờ cũng chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật. Phospho có mặt ở trong hầu hết các thành phần của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại phospho vô cơ như KH2PO4, K2HPO4, KNO3…[31]. Việc bổ sung phosphat (nhất là phosphat kali) vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường [31]. Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng BC như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi lượng thì vi khuẩn Gluconacetobacter không thể sinh trưởng và phát triển bình thường được. Đối với Gluconacetobacter, nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử dụng là nước dừa già, dịch hoa quả, rỉ đường…, khi nuôi cấy không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng nữa [31]. 1.4.4. Các chất kích thích sinh trưởng Các vitamin pyrodoxine, axit nicotinic, p–aminobenzoic axit (pABA), biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại. Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy Gluconacetobacter thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hóa học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần). Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol. Ngoài ra, trong nước dừa còn có nhiều khoáng chất, vitamin, axit amin… phù hợp cho quá trình sinh trưởng và quá trình hình thành màng BC 11 của vi khuẩn Gluconacetobacter [31]. 1.4.5. Điều kiện nuôi cấy 1.4.5.1. Độ pH Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm axit acetic nhằm axit hóa môi trường. Đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật có hại [31]. 1.4.5.2. Nhiệt độ Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Gluconacetobacter vào khoảng 25 - 300C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [19]. 1.4.5.3. Độ thông khí Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc [19]. Do đó, điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong thực tế độ thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp BC. 1.4.5.4. Thời gian nuôi cấy Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48 giờ, hình thành một lớp trong và ngày càng dày. Theo Thesis Holmes (2004) [37], hàm lượng glucose trong môi trường giảm nhất sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì v i khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5 – keto axit gluconic trong quá trình trao đổi chất. Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng thái tốt nhất. 12 1.4.5.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V) Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên men h =1,25 cm [10]. 1.5. Ứng dụng của màng BC Màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học đã dùng màng BC làm màng phân tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng Brown. E. (2007) [21], Jonas và Farad (1998) [29] đã dùng màng như một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học. Trong công nghiệp giấy, màng BC được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao... Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng để sản xuất thạch dừa, một món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á… 1.5.1. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông Các loại vi khuẩn gây thối rữa là nguyên nhân làm cho thực phẩm bị hư hỏng và làm giảm thời gian sử dụng của sản phẩm thực phẩm. Vấn đề bảo quản sản phẩm thực phẩm tránh khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng được đặc biệt quan tâm. Có nhiều cách để bảo quản sản phẩm, như dùng các loại hóa chất bảo quản là một cách khá phổ biến và cũng gây nhiều nhức nhối cho xã hội do tính độc hại của chúng. Theo nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) [14] màng BC sau khi xử lý có độ dẻo dai cao, hút ẩm tốt, ngăn cản sự xâm nhập của vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc do đó có thể ứng dụng làm màng bao chống vi sinh vật, đồng thời giảm lượng hóa chất bảo quản trong thực phẩm. Ứng dụng làm màng bảo quản thực phẩm là một trong những ứng dụng 13 quan trọng của cellulose vi khuẩn trong ngành công nghệ bao bì trong những năm gần đây (Yoshinaga 1997) [41]. 1.5.2. Ứng dụng trong y học Nhờ những đặc tính độc đáo mà màng BC đã được xem là một nguồn polymer sinh học mới. Trong y học, màng BC đã được sử dụng như vật liệu sinh học che phủ vết thương nhờ khả năng bền trong môi trường ẩm, thấm hút dịch, không gây kích ứng da [35]. Tuy nhiên, giá thành màng BC nhập ngoại khá đắt (35 – 40 nghìn đồng/1 chiếc có kích thước 15×10cm). Ở Việt Nam, mới đây tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự (2012) đã chế tạo thành công chế phẩm màng BC trị bỏng có tẩm dung dịch Becberin clorid 0,1% có tác dụng kháng khuẩn và tái tạo mô tốt, không gây đau, dị ứng hoặc kích ứng da, không gây các rối loạn toàn thân [11]. Tác giả Wan đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ Gluconacetobacter dùng trong trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaija và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [26], [29]. 1.5.3. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác Màng BC (cellulose vi khuẩn) được sử dụng thay thế cho cellulose thực vật trong sản xuất cellulose có độ tinh khiết cao, góp phần giảm bớt nguồn nguyên liệu từ thực vật (Sherif. 2008) [35]. Những nghiên cứu tìm nguồn thay thế bằng cellulose vi khuẩn, Barbara et al., (2008) [20] tạo ra giấy từ cellulose vi khuẩn với sự vượt trội về độ dẻo dai, bền, chắc. Sản xuất giấy điện tử từ cellulose vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R. 2005) [28] Cellulose vi khuẩn hiện được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với những ứng dụng thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển sản xuất hàng loạt. Các lĩnh vực ứng dụng cellulose vi khuẩn được trình bày trong bảng 1.2