Tài liệu ảnh hưởng của levamíole lên các chỉ tiêu sinh lý miễn dịch cá tra giống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NG Y N THANH THẢO ẢNH HƯ NG CỦA A ISO N C C CH TI SINH I N CH TR N C TRA GI NG (Pangasianodon hypophthalmus) ẬN ĂN T T NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH N ÔI TRỒNG THỦY SẢN 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NG Y N THANH THẢO ẢNH HƯ NG CỦA A ISO N C C CH TI SINH I N CH TR N C TRA GI NG Pangasianodon hypophthalmus) ẬN ĂN T T NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH N ÔI TRỒNG THỦY SẢN C N BỘ HƯỚNG ẪN G T NG Y N THANH PHƯƠNG 2014 ẢNH HƯ NG CỦA A ISO N C C CH TI SINH I N CH TR N C TRA GI NG Pangasianodon hypophthalmus) 1 1 ) nuôi. 1 – – – ; (3) (4) – – – 38±0,20 ,43±2,23 p<0,05). N k 1. GIỚI THIỆU Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng nhiệt đới có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho phát triển ngành nông nghiệp, đặc biệt là nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây, nghề nuôi thủy sản Việt Nam nói chung, đồng bằng sông Cửu Long nói riêng có bước phát triển nhanh và đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có lợi thế về địa lí với diện tích mặt nước nội địa gần 1 triệu ha, chiếm gần 30% diện tích tự nhiên của vùng có hệ thống sông ngòi chằng chịt, đa d ng về lo i h nh thủy vực với những điều kiện đó t o thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản phát triển. Bên c nh những thuận lợi th ngành thủy sản c ng gặp không ít khó khăn. Th o báo cáo của T ng c c thủy sản năm 013 th t nh h nh dịch bệnh của động vật thủy sản ĐBSCL ảy ra trên nhiều đối tượng nuôi và di n biến ph c t p, t ng diện tích thiệt h i là 3 ha (cá tra) và 00 ha (tôm). Trong đó, cá tra là đối tượng nuôi chủ lực khu vực nội địa mang l i hiệu quả kinh tế cao nên ngư i nuôi không ng ng m rộng diện tích, quy mô sản u t c ng như mật độ nuôi tăng cao làm ảnh hư ng u đến 1 ch t lượng môi trư ng nước d n đến t nh h nh dịch bệnh ngày càng lây lan và gây thiệt h i kinh tế lớn cho ngư i nuôi, trong các bệnh nguy hiểm th bệnh gan, thận mủ do vi khu n Edwardsiella ictaluri là thư ng gặp trên cá tra. Trước những thách th c đó, hiện nay có nhiều lo i thuốc, hóa ch t được nghiên c u nhằm kích thích hệ mi n dịch không đặc hiệu như β-glucans, vitamin C hay vaccin. Tuy nhiên chưa có nghiên c u nào về hóa ch t l vamisol trên cá tra. V thế, đề tài “Ảnh hưởng của evami ole lên các chỉ tiêu inh lý miễn dịch trên cá tra giống Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện nhằm kích thích hệ mi n dịch không đăc hiệu cá và giảm sử d ng hóa ch t trong quá tr nh nuôi. 2. 2.1. PHƯƠNG PH P NG Y N CỨU Th nghi m Ảnh hưởng của evami ole n các chỉ tiêu inh lý miễn dịch trên cá tra 2.1.1. Bố trí thí nghi m Thí nghiệm được tiến hành t tháng 06/ 014 đến tháng 1 / 014. Địa điểm: cá tra được nuôi trong các giai đặt trong ao nuôi thương ph m t i ã Tân Lộc, quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý mi n dịch t i Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trư ng Đ i học Cần Thơ. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ng u nhiên với 4 nghiệm th c (bảng 2.1); mỗi nghiệm th c lặp l i 3 lần với mật độ là 100 con/giai. Th i gian bố trí thí nghiệm là 1 tuần, trong th i gian này cá được cho ăn 3% khối lượng thân và cho ăn lần/ngày, th c ăn th a được vớt ra khỏi giai. Cá bố trí thí nghiệm có khối lượng khoảng g/con, có màu s c sang bóng. Th c ăn sau khi trộn L vamisol được áo dầu mực (10 mL/kg th c ăn) và được trữ trong tủ l nh đến khi cho cá ăn Bảng 2.1: Thời gian cho cá ăn thức ăn có trộn levami ole ở các nghi m thức Nghi m thức Thời gian cho cá ăn thức ăn trộn levami ole tuần) 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 0 0 0 0 0 0 50 mg/kg thức ăn gián oạn 50 mg/kg thức ăn liên tục 150 150 0 150 150 150 0 150 150 150 0 150 250 mg/kg thức ăn gián oạn 250 0 250 0 250 0 Đối chứng 2.1.2. Thu mẫu và ghi nhận ố li u Trong suốt quá tr nh thí nghiệm m u máu cá được thu t i các th i điểm 0 gi , 14 ngày, 8 ngày, 6 ngày và 84 ngày của t ng nghiệm th c. Mỗi lần thu 6 con/giai. M u máu được thu bằng kim tiêm 1 mL đã tráng qua h parin, thu khoảng 0, -0, mL/m u và ch a trong ống p ndoff 1, mL. M u được giữ l nh trong suốt th i gian l y m u. M u tỳ t ng được thu ng u nhiên 6 con/giai t cá đã thu m u máu. Sau đó được trữ l nh trong dung dịch L-15. Sau đó, m u máu được li tâm thu huyết tương để phân tích các 2 chỉ tiêu về mi n dịch: hàm lượng b thể complement, kháng thể immunoglobulin (IG). Qui trình thu và ử lý huyết tương trong thu m u: M u máu thu xong Thu huyết tương Ly tâm 6 phút (6.000 vòng) Trữ trong tủ -80°C đến khi phân tích m u 2.2. Th nghi m 2 cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri 2.2.1. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Chủng vi khu n Edwardsiella ictaluri được trữ trong môi trư ng glyc rol và được c y chuyền trên môi trư ng TSA, ủ 8°C sau 48 gi kiểm tra tính thuần của vi khu n được phân lập và nuôi tăng sinh vi khu n. Sau đó chuyển vi khu n sang ống pp ndof 1, mL tiệt trùng, đ m ly tâm 13.000 vòng/phút 4°C trong 10 phút và lo i bỏ dung dịch phía trên, dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khu n và được lặp l i 3 lần. Lần ly tâm cuối, lo i bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng mL dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều m u. Xác định mật độ vi khu n với bước sóng 610 nm và điều chỉnh OD tương ng. OD=1±0,0 tương đương với mật độ vi khu n là 109 CFU/mL. Vi khu n pha loãng: 106 CFU/mL và tiến hành bố trí thí nghiệm. Tiếp th o, ác định l i mật số vi khu n bằng cách dùng pip t l y 0  L (lặp l i 6 lần) dung dịch vi khu n lên đĩa p tri có môi trư ng TSA ủ 28°C sau 48 gi , đếm số lượng khu n l c trung b nh, ác định mật độ vi khu n bằng công th c: Số tế bào vi khu n (CFU/mL)=Số khu n l c trên đĩa x hệ số pha loãng 0 2.2.2. Bố trí thí nghi m Nguồn nước bố trí thí nghiệm được l y t ao sau đó khử trùng bằng chlorin . Nguồn cá bố trí thí nghiệm t các giai đang nuôi thí nghiệm 1 sau 4 tuần và 1 tuần; cá có màu s c tươi sáng, bơi lội nhanh nhẹn được bố trí ng u nhiên vào ô thí nghiệm mật độ 10 con/ ô nhựa (4 L) ch a 30 L nước có s c khí và được trữ để qu n với điều kiện thí nghiệm 2 - 3 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và cho cá ăn th c ăn thí nghiệm 4 nghiệm th c th o 3% khối lượng thân. Thí nghiệm cảm nhi m được lặp l i 3 lần, mỗi con cá được tiêm 0,1 mL dung dịch vi khu n mật độ 106 CFU/mL 4 nghiệm th c và 0,1 mL dung dịch NaCl 0,8 % nghiệm th c đối ch ng, tiêm oang b ng (gốc vi ngực). 2.2.3. Thu mẫu uan sát và ghi nhận các d u hiệu bệnh lý, số cá chết trong suốt ngày gây cảm nhi m. Tiến hành thu m u cá l đ và ghi nhận l i d u hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể m u cá. Thu m u thận của cá có d u hiệu bệnh mang đến phòng ét nghiệm bệnh thủy sản t i Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản-Đ i học Cần Thơ. Phương pháp ph n t ch và xử lý ố li u NBT được phân tích như sau, tỳ t ng được ủ trong 500 µL L-15 trung hòa. Sau đó, m u được nghiền với dung dịch L-15 trung hòa. L y thể tích dung dịch tế bào thu 2.3. 3 được sau lọc và nghiền cho vào các tuýp và ly tâm l nh 0,6 g trong phút. Lo i bỏ dịch trong n i bên trên, cho thêm 00 µL L-15 trung hòa và ly tâm. Lặp l i hai lần. Sau đó tiến hành làm đư ng chu n. Tiếp t c ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút và đ m ly tâm 0,6 g trong phút và lo i bỏ dịch trong bên trên. Thêm 150 µL NBT lần lượt vào mỗi m u và thêm lần lượt 0, , 0, , 100, 125 và 150 µL NBT rồi định m c lên 1 0 µL với dung dịch PBS. Ủ cả m u và đư ng chu n trong 1 gi nhiệt độ phòng rồi ly tâm 0,6 g trong 5 phút, lo i bỏ dịch trong và cho vào mỗi tuýp methanol, KOH (2M) và NN-dimethylformamide trộn đều và ly tâm 5 phút. Đọc kết bước sóng 550 nm. Phân tích ho t động của lyso ym trong huyết tương th o phương pháp của llis (1 0) and Milla ( 010). àm lượng mi n dịch globulin th o Si icki and Ard fson (1 3). àm lượng b thể (complement) theo Sunyer and Tort (1995). Phương pháp ử lý số liệu phân tích ANOVA và phép thử DUNCAN. KẾT Q Ả THẢO ẬN 3.1. Các chỉ tiêu inh lý miễn dịch 3.1.1. Hàm lư ng miễn dịch NBT (mg/ml) trong t tạng cá tra àm lượng mi n dịch NBT trong 1 tuần thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.1 như sau: 3. Bảng 3.1 Hàm lư ng NBT (mg/ml) có trong t tạng cá tra Nghi m thức Ngà 0 Ngà a Ngà 2 a Ngà 5 a Ngà a 0,22±0,17a Đối chứng 0,09±0,04 150 gián oạn 0,09±0,03a 0,14±0,02ab 0,14±0,08a 0,30±0,18b 0,38±0,20b 150 liên tục 0,09±0,03a 0,11±0,03ab 0,17±0,07a 0,14±0,09a 0,15±0,10a 250 gián oạn 0,09±0,03a 0,16±0,07b 0,17±0,12a 0,37±0,21b 0,36±0,16b 0,11±0,03 0,14±0,09 0,13±0,20 Ngày thu m u 0 gi th nh n chung t t cả các nghiệm th c không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê m c p 0,0 . Trong th i gian đầu bố trí thí nghiệm cá còn nhỏ và chưa b sung l vamisol vào th c ăn t t cả các nghiệm th c nên khả năng mi n dịch không đặc hiệu của cá còn th p d n đến hàm lượng NBT trong tỳ t ng chưa cao và tương đương nhau. Sang ngày thu m u th 14, các nghiệm th c cho ăn gián đo n có hàm lượng NBT cao hơn so với nghiệm th c cho ăn liên t c và nghiệm th c đối ch ng, nghiệm th c cho ăn 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng NBT cao nh t là 0,16±0,07 mg/ml và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm th c còn l i với m c ý nghĩa p 0,05. Hàm lượng NBT ngày th 8 tăng cao hơn so với ngày th 14, hai nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c và 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng NBT tương đương nhau là 0,17±0,07 mg/ml, nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n v n chưa kích thích hệ mi n dịch không đặc hiệu nên hàm lượng NBT v n không có thay đ i so với đối ch ng. Tuy nhiên lần thu m u này giữa các nghiệm th c khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau (p>0,05). Vào ngày thu m u 6, các nghiệm th c b sung 4 l vamisol gián đo n có hàm lượng NBT tăng cao so với nghiệm th c b sung l vamisol liên t c và nghiệm th c đối ch ng. àm lượng NBT tiếp t c tăng và cao nh t nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n là 0,37±0,21 mg/ml tiếp th o là nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n là 0,30±0,18 mg/ml, cả hai nghiệm th c này điều khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm th c đối ch ng và nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c. iêng nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c có u hướng giảm so với lần thu m u ngày 8. Ngày thu m u 84, hàm lượng NBT hai nghiệm th c cho ăn gián đo n có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm th c còn l i. Tuy nhiên, nghiệm th c 1 0 gián đo n th hàm lượng NBT v n tiếp t c tăng và đ t giá trị cao nh t là 0,38±0,20 mg/ml và không có khác biệt thống kê so với nghiệm th c 0 gián đo n. nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c có u hướng tăng nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối ch ng. Nh n chung qua 1 tuần thí nghiệm th nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng NBT cao so với các nghiệm th c còn l i và làm kích thích mi n dịch không đặc hiệu của cá tra. Mặc khác, việc b sung l vamisol liên t c hay với nồng độ cao không kích thích tốt hệ mi n dịch của cá. Kết quả nghiên c u của Bui Thi Bich ang et, al (2013) về ảnh hư ng của lipopolysaccharid (LPS) lên hệ mi n dịch cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) th ho t tính NBT không có sự thay đ i nhiều so với đối ch ng và có u hướng giảm các lần thu m u. Tuy nhiên, lần thu m u th nghiệm th c 0,01% LPS th ho t tính của NBT cao hơn các nghiệm th c còn l i. Theo Sajid Maqsood ( 00 ) đã nghiên c u sự ảnh hư ng của l vamisol (0, 1 , 0 và 00 mg/kg th c ăn) lên việc điều hòa mi n dịch và tăng trư ng của cá chép (Cyprinus carpio) th ho t động của b ch cầu trung tính được tăng cư ng trong t t cả các nghiệm th c có b sung l vamisol vào ngày th nghiệm th c b sung 0 mg/kg th c ăn th chỉ số NBT cao nh t, rồi đến nghiệm th c b sung 00 mg/kg th c ăn sau cùng lần lượt là nghiệm th c 1 mg/kg và đối ch ng. Sau đó, ngày th 0 chỉ số NBT các nghiệm th c có u hướng giảm. Trong nghiên c u khác, theo Logambalet (2000) th ho t động hô h p của b ch cầu được ác định bằng việc giảm NBT b i các gốc superoxide, hàm lượng l vamisol tăng th làm tăng ho t động hô h p của b ch cầu tăng và cao nh t là b sung 0,5%. Kết quả nghiên c u của đề tài nằm trong khoảng phù hợp với kết quả nghiên c u của các tác giả, khi b sung l vamisol với liều lượng phù hợp th làm tăng cư ng đáp ng mi n dịch trên cá, tùy vào t ng loài cá mà l vamisol có nồng độ để kích thích mi n dịch khác nhau. 3.1.2. Hàm lư ng miễn dịch glo ulin IG (mg/ml) trong máu cá tra àm lượng mi n dịch globulin ( ) trong máu hiển thị cho khả năng mi n dịch không đặc hiệu của cá. àm lượng mi n dịch được thể hiện bảng 3. lần thu m u 0 gi , nh n chung các nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau m c ý nghĩa p 0,05. Ngày thu m u th 14, hàm lượng mi n dịch tăng lên so với ngày thu m u 0 gi b i l vamisol kích thích hệ mi n dịch không đặc hiệu của cá. các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 5 nghiệm th c đối ch ng và các nghiệm th c này không có sự khác biệt thống kê với m c ý nghĩa p 0,0 trong đó nghiệm th c 0 mg/kg có hàm lượng cao nh t là 13,45±0,41 mg/ml. Bảng 2 Hàm lư ng miễn dịch glo ulin IG mg/ml) trong máu cá tra Nghi m thức Đối chứng Ngà 0 9,95±1,52 Ngà a Ngà 2 10±2,05 a 11,1±1,48 Ngà 5 a 11,78±1.93 Ngà a 10,93±2.63ab 50 gián oạn 9,09±1,67a 12,75±1,93b 11,55±1,21ab 13,07±2.20a 12,43±2.23b 50 liên tục 10,86±2,9a 11,98±3,49b 10±2,18c 12,26±2.22a 10,63±2.70a 250 gián oạn 10,86±2,9a 13,45±1,74b 12,35±2.02bc 12,87±3.19a 11,93±2.28ab Ngày th 8, các nghiệm th c hàm lượng có u hướng giảm so với ngày thu m u 14, trong đó cao nh t là nghiệm 0 mg/kg gián đo n là 1 ,35±2,02 mg/ml và th p nh t là nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c là 10±2,18 mg/ml khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng. Ngày thu m u 6, hàm lượng có sự tăng so với ngày thu m u trước, nghiệm th c có giá trị cao nh t là 1 0 mg/kg gián đo n đ t 13,07±2,20 mg/ml. Tuy nhiên trong lần thu m u này giữa các nghiệm th c không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê m c ý nghĩa p 0,0 . Ngày thu m u 84, hàm lượng của cá cao nh t nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n là 1 ,43±2,23 mg/ml và th p nh t nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c là 10,63±2,70 mg/ml, nghiệm th c b sung l vamisol 1 0 mg/kg th c ăn gián đo n làm kích thích hệ mi n dịch tốt nh t trong các nghiệm th c. ua 1 tuần thí nghiệm hàm lượng mi n dịch cao nh t nghiệm th c cho ăn b sung 1 0 mg/kg gián đo n, như vậy khi cho ăn gián đo n với liều thích hợp s làm kích thích hệ mi n dịch không đặc hiệu của cá. còn b sung l vamisol với liên t c hay cho ăn gián đo n với liều cao chưa kích thích tốt hệ mi n dịch của cá được thể hiện qua hàm lượng trong huyết tương. 3.1.3. Hàm lư ng l o me (U/ml) trong hu t tương Hàm lượng mi n dịch lyso ym trong huyết tương thể hiện khả năng mi n dịch không đặc hiệu của cá. Được biểu thị bảng 3.3 Bảng Hàm lư ng l o me Nghi m thức Đối chứng Ngà 0 82,05±3,18 /ml) trong hu t tương Ngà a 90,27±4,68 Ngà 2 a 92,51±2,12 Ngà 5 a 92,54±0,54 Ngà a 93,92±1,02a 50 gián oạn 88,82±1,45a 126,45±7,75b 117,32±9,94b 147,83±7,34b 213,09±1,32c 50 liên tục 84,26±2,77a 126,45±1,63b 135,44±7,27b 205,30±1,11c 193,01±10,74b 250 gián oạn 83,33±4,00a 128,97±1,29b 123,83±5,62b 234,83±7,86d 200,03±2,74bc Ngày thu m u 0 gi nh n chung các nghiệm th c không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê m c p 0,0 . Ngày thu m u th 14, các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối ch ng (p 0,0 ). àm lượng 6 lyso ym cao nh t nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n đ t 1 8, ±0, U/ml, tuy nhiên không có sự khác biệt thống kê với hai nghiệm th c có b sung l vamisol còn l i (p 0,0 ). àm lượng lyso ym ngày th 8, các nghiệm th c b sung l vamisol khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm th c đối ch ng (p 0,0 ). Nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c có u hướng tăng so với ngày 14 và đ t giá trị cao nh t là 13 ,44± , U/ml. Lần thu m u này, các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau (p 0,0 ). Ngày thu m u th 6, nh n chung, hàm lượng lyso ym tăng so với ngày thu m u th 8. àm lượng lyso ym các nghiệm th c có b sung levamisol điều khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhau và khác biệt so với nghiệm th c đối ch ng (p 0,0 ). nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng lyso ym cao nh t là 34,83± ,86 U/ml. Ngày thu m u 84, các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng và nghiệm th c cho ăn gián đo n khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm th c cho ăn liên t c (p 0,0 ). nghiệm th c 150 mg/kg gián đo n tăng so với ngày thu m u 6 và đ t giá trị cao nh t là 213,09±1,32. Nh n chung qua 1 tuần thí nghiệm, các nghiệm th c có b sung l vamisol có hàm lượng lyso ym cao hơn nghiệm th c đối ch ng. nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng lyso ym cao hơn các nghiệm th c còn l i và làm kích thích hệ mi n dịch không đặc hiệu của cá tra. Kết quả nghiên c u của Bui Thi Bich Hang et. al (2013) về ảnh hư ng của lipopolysaccharid (LPS) lên hệ mi n dịch cá tra (pangasianodon hypophthalmus) với các liều (0, 3, 1 và 4 ) mg LPS/kg th hàm lượng lyso ym nghiệm th c 3 và 1 mg LPS/kg khác biệt có ý nghĩa (p 0,0 ) và cao nh t là nghiệm th c 3 mg LPS/kg, nghiệm th c 4 mg LPS/kg khác biệt không có ý nghĩa so với đối ch ng (p 0,0 ). Như vậy, mỗi ch t khác với liều lượng khác nhau th tác động lên hệ mi n dịch không đặc hiệu khác nhau. 3.1.4. Hàm lư ng th (complement) trong hu t tương Bảng hàm lư ng th (Unit) trong hu t tương Nghi m thức Đối chứng Ngà 0 4,53±1,04 Ngà a 5,46±1,40 Ngà 2 a 6,86±2,73 Ngà 5 a 6,16±0,84 Ngà a 6,68±1,35a 50 gián oạn 5,21±1,30a 10,61±1,83b 10,43±1,05b 11,98±1,45b 12,67±1,43c 50 liên tục 5,82±1,24a 10,34±2,52b 11,37±1,47b 11,10±1,47b 11,01±1,45b 250 gián oạn 5,43±1,54a 12,25±1,82b 12,22±1,61b 11,88±2,11b 11,55±1,19bc Ngày thu m u 0 gi , nh n chung các nghiệm th c khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p 0,0 ). Ngày thu m u th 14, các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau nhưng có khác biệt thống kê so với nghiệm th c đối ch ng (p 0,0 ), trong đó hàm lượng b thể cao nh t nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n là 1 , ±1,8 Unit. Ngày thu m u 28, các nghiệm th c có b sung levamisole không khác biệt có ý nghĩa với nhau nhưng có khác biệt thống kê so với 7 nghiệm th c đối ch ng (p 0,0 ). Nghiệm th c 0 gián đo n có hàm lượng b thể cao nh t là 1 , ± 1,61 Unit. Ngày thu m u th 6 c ng tương tự như ngày thu m u th 8 và 14, các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng (p 0,0 ). Nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng b thể cao nh t đ t 11, 8±1,4 Unit. Ngày thu m u th 84, các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng (p 0,0 ). Nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng b thể cao nh t là 1 ,6 ±1,43 Unit, nghiệm th c này khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c nhưng l i khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n. ua 1 tuần thí nghiệm, hàm lượng b thể đ t giá trị cao nghiệm th c có b sung l vamisol gián đo n, nhưng cao nh t là liều 1 0 mg/kg gián đo n. 3.2. K t uả g cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra Cá sau khi gây cảm nhi m có các d u hiệu cá bệnh giống ngoài tự nhiên như: u t hiện các d u hiệu bệnh lý bên ngoài: ho t động bơi lội không b nh thư ng, vây bị tưa, màu s c cơ thể nhợt nh t, kết quả giải ph u bên trong: thận u t hiện đốm tr ng nhỏ, gan bầm đ n, nội quan tái. Sang ngày th 4, gan cá b t đầu có u t hiện đốm tr ng 1- mm, các d u hiệu bệnh lý giống như miêu tả trước của T Thanh Dung và ctv ( 004); Đặng Th y Mai Thy và Đặng Thị oàng Oanh ( 010). Tỉ lệ cá chết ghi nhận sau khi gây cảm nhi m được tr nh bài bảng 3.5. Bảng 5 Tỉ l nhiễm ống (%) ở các nghi m thức ua hai lần thu mẫu au khi g Nghi m thức Ngà 2 (%) Ngà (%) a 16,67±3,3a 50g/kg gián oạn 50g/kg liên tục 40,00±0,0ab 60,00±10c 63,33±3,3b 50,00±5,7b 250g/kg gián oạn 43,00±3,3bc 70,00±10b Đối chứng 23,33±3,3 cảm ,05 lần thu m u cảm nhi m ngày th 8, cá nghiệm th c có b sung levamisole có tỉ lệ sống cao hơn so với nghiệm th c không b sung l vamisol . ua bảng 3.5 cho th y nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng và 1 0 mg/kg gián đo n. Tỉ lệ sống cao nh t nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c là 60±10%. Lần thu m u cảm nhi m ngày 84, b sung l vamisol với liều khác nhau th kết quả cho th y tỉ lệ sống đã được tăng lên các nghiệm th c có b sung l vamisol gián đo n nhưng ngược l i nghiệm th c cho ăn liên t c và đối ch ng giảm so với lần thu m u đầu tiên. Tỉ lệ sống cao nh t đ t 0±10% nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n tuy nhiên không có khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n và 0 mg/kg gián đo n m c ý nghĩa p 0,05. Nh n chung, qua hai lần thu m u cảm nhi m th tỉ lệ sống có u hướng tăng các nghiệm th c có b sung 8 l vamisol cho ăn gián đo n. Khi b sung l vamisol gián đo n làm tăng khả năng đáp ng mi n dịch không đặc hiệu của cá. Th o Đặng Thị oàng Oanh và Nguy n Thanh Phương (2012) khi tiêm vi khu n E. ictaluri (0,25x106 CFU/mL), kết quả thí nghiệm điều trị thuốc kháng sinh rythromycin thiocyanat th y cá nghiệm th c cho ăn th c ăn không trộn thuốc và gây cảm nhi m (nghiệm th c đối ch ng) cá chết t ngày 3 đến ngày sau khi tiêm vi khu n, tỉ lệ sống của cá là 33, %. nghiệm th c cho ăn th c ăn có trộn thuốc, cá gây cảm nhi m c ng b t đầu chết vào ngày th 3 đến ngày th 8 sau khi tiêm vi khu n tỉ lệ sống là 6 , % ngưng chết đến kết thúc thí nghiệm. So sánh kết quả thí nghiệm có tỉ lệ sống th p hơn của tác giả cả nghiệm th c đối ch ng và nghiệm th c có sử d ng thuốc. Nghiên c u của Nguy n oàng Nhật Uyên (2012) về đáp ng mi n dịch của cá tra gây ra b i vi khu n E. ictaluri có liều tiêm 1, 105 CFU/mL th có sự khác biệt đáng kể về tỉ lệ chết nghiệm th c đối ch ng cao nh t trên 0% còn các nghiệm th c được ngâm vi khu n nhược độc nhằm kích thích mi n dịch có số cá chết giảm th o liều tiêm. àm lượng kháng thể trong máu có liên quan đến tỉ lệ chết của cá tra, thí nghiệm lượng kháng thể càng cao th tỉ lệ chết càng th p. L vamisol có vai trò là một ch t làm tăng đáp ng mi n dịch trên cá tra và mang l i kết quả tốt, làm nâng cao tỉ lệ sống khi có vi khu n gây bệnh u t hiện trên cá. Kết quả nghiên c u có tỉ lệ sống tương đương với của các tác giả dùng lo i hóa ch t khác để làm tăng đáp ng mi n dịch trên cá tra. Khả năng mi n dịch không đặt hiệu của cá với vi khu n E. ictaluri được thể hiện qua hàm lượng NBT (mg/ml) trong tỳ t ng bảng 3.6 Bảng Hàm lư ng NBT (mg/ml) trong t tạng ua hai lần cảm nhiễm trên cá tra Nghi m thức Ngà 2 Ngà Đối chứng 50 gián oạn a 0,08±0,04 0,09±0,04a 0,07±0,03a 0,53±0,16b 50 liên tục 250 gián oạn 0,12±0,02a 0,10±0,05a 0,20±0,07a 0,51±0,18b Kết quả t bảng 3.6 cho th y chỉ số NBT tăng dần qua hai lần thu m u. lần thu m u cảm nhi m ngày 8, chỉ số NBT giữa các nghiệm th c khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau (p>0,05). Hàm lượng NBT cao nh t nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c là 0,1 ±0,0 mg/ml và th p nh t là nghiệm th c đối ch ng là 0,08±0,04 mg/ml. Khả năng mi n dịch không đặc hiệu của cá có b sung l vamisol sau khi gây cảm nhi m cao hơn so với nghiệm th c không b sung l vamisol vào th c ăn. Sang lần thu m u cảm nhi m ngày 84 có sự khác biệt r các nghiệm th c, nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng NBT tăng cao nh t là 0, 3±0,16 mg/ml, hàm lượng NBT cao tiếp th o nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n là 0, 1±0,18 mg/ml và cả hai nghiệm th c ngày khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng và 1 0 mg/kg liên t c m c ý nghĩa p 0,05. Khả năng mi n dịch không đặt hiệu của cá với vi khu n E. ictaluri được thể hiện qua hàm lượng (mg/ml) trong tỳ t ng bảng 3.7 9 Bảng nhiễm Hàm lư ng glo ulin IG mg/ml) trong máu cá tra ở lần thu mẫu cảm Nghi m thức Ngà 2 Đối chứng Ngà 13,47±0,54 a 50 gián oạn 14,94±1,26a 50 liên tục 250 gián oạn ab 13,67±1,04a 15,8±1,17b 13,53±1,13a 14,47±1,15ab 16,28±2,78 18,70±3,71b Kết quả t bảng 3. , lần thu m u cảm nhi m ngày th 8 hàm lượng nghiệm 0 mg/kg gián đo n khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm th c đối ch ng và 1 0 mg/kg gián đo n. àm lượng đ t giá trị cao nh t nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n là 18, 0±3,71 mg/ml. Ngày 84, hàm lượng nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n tăng lên so với lần cảm nhi m ngày 28 và có khác biệt ý nghĩa thống kê với nghiệm th c đối ch ng và nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c. nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c và 0 mg/kg gián đo n khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng với m c ý nghĩa p 0,0 . àm lượng cao nh t nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n là 1 ,8±1,17 mg/ml. Khả năng mi n dịch không đặt hiệu của cá với vi khu n E. ictaluri được thể hiện qua hàm lượng lyso ym (U/ml) trong tỳ t ng bảng 3.8 Bảng 8 Hàm lư ng l o me Nghi m thức Đối chứng /ml) trong máu cá tra ở lần thu mẫu cảm nhiễm Ngà 28 94,85±0,51 Ngà a 96,86±0,93a 50 gián oạn 168,09±12,87b 312,45±11,84b 50 liên tục 185,36±6,71b 235,92±3,11c 250 gián oạn 186,24±2,55b 288,23±2,77d lần thu m u cảm nhi m ngày th 8, các nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt có ý nghĩa so với nghiêm th c đối ch ng (p 0,0 ). Nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng lyso ym cao nh t là 186, 4± , U/ml, tuy nhiên nghiệm th c này khác biệt không có ý nghĩa so với các nghiệm th c còn l i có b sung l vamisol . Sau 1 tuần thí nghiệm, có sự khác biệt r giữa các nghiệm th c, nghiệm th c có b sung l vamisol khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhau và với nghiệm th c đối ch ng (p<0,05). àm lượng lyso ym cao nh t nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n đ t giá trị là 31 ,4 ±11,84 U/ml. Nh n chung hàm lượng lyso ym tăng qua hai lần thu m u, nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n kích thích hệ mi n dịch không đặc hiệu của cá tốt hơn các nghiệm th c còn l i. Khả năng mi n dịch không đặt hiệu của cá với vi khu n E. ictaluri được thể hiện qua hàm lượng b thể (compl m nt) trong tỳ t ng bảng 3. 10 Bảng 3.9 Hàm lư ng Nghi m thức Đối chứng th nit) trong máu cá tra ở lần thu mẫu cảm nhiễm Ngà 2 10,26±2,80 Ngà a 12,10±0,77a 50 gián oạn 50 liên tục 12,25±0,84ab 12,64±0,60b 14,94±1,19b 12,87±0,78a 250 gián oạn 14,98±092c 14,36±0,80b Kết quả t bảng 3. , lần thu m u cảm nhi m th nh t, các nghiệm th c 1 0 mg/kg liên t c và 0 mg/kg gián đo n khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng (p 0,0 ). Nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng b thể cao nh t đ t giá trị là 14, 8±0 Unit. lần thu m u cảm nhi m ngày th 84 có hàm lượng b thể tăng so với ngày th 14. nghiệm th c b sung l vamisol gián đo n khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c đối ch ng và 1 0 mg/kg liên t c (p 0,0 ). àm lượng b thể đ t giá trị cao nh t nghiệm th c 1 0 mg/kg gián đo n là 14, 4±1,1 Unit và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm th c 0 mg/kg gián đo n (p 0,0 ). Sau khi cảm nhi m tuần th 1 cho th y nghiệm th c b sung l vamisol với liều 1 0 mg/kg gián đo n có hàm lượng b thể cao nh t và nghiệm th c này kích thích hệ mi n dịch không đặt hiệu của cá tốt hơn các nghiệm th c còn l i. KẾT LUẬN À ĐỀ XUẤT 4.1. K t luận Nh n chung, nghiệm th c b sung l vamisol liều 1 0 mg/kg th c ăn cho ăn gián đo n làm kích thích hệ mi n dịch không đặc hiệu của cá tốt hơn các nghiệm th c còn l i: 150 mg/kg liên t c và 0 mg/kg gián đo n thể hiện qua hàm lượng NBT trong tỳ t ng, trong huyết tương, b thể trong huyết thanh và lyso ym trong huyết tương. Khi b sung l vamisol vào th c ăn làm tăng hệ mi n dịch của cá, làm nâng cao tỉ lệ sống sau khi gây cảm nhi m với vi khu n E. ictaluri. 4. 4.2. Đ xu t Việc b sung l vamisol vào th c ăn làm tăng kích thích mi n dịch không đặc hiệu trên cá tra giống. V vậy, có thể nghiên c u b sung l vamisol trên các đối tượng cá giống khác nhằm kích thích mi n dịch và làm tăng tỉ lệ sống của cá. TÀI IỆ THA KHẢO Bui Thi Bich Hang, Sylvain Milla, Virginie Gillardin, Nguyen Thanh Phuong, Patrick Kestemont (2013) In vivo effects ofEscherichia colilipopolysaccharide on regulation of immune response and protein expression in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus). Fish & Shellfish Immunology 34: 339 - 347 Đặng Mai Thuy và Đặng oàng Oanh, 010. Đặc điểm mô bệnh và huyết học trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhi m vi khu n Edwardsiella ictaluri trong điều kiện thực nghiệm. T p chí khoa học 010. Trư ng Đ i học Cần Thơ. 11 Đặng Thị oàng Oanh và Nguy n Thanh Phương ( 01 ). Thử nghiệm và điều trị bệnh do vi khu n . ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). T p chí khoa học 01 : c 146-154. Ellis AE. Lysozyme activity. In: Stolen TC, Fletcher PD, Anderson BS,Roberson BS, Muiswinkel WB, editors. Technique infish immunology.NewYork: SOS Publications; 1990. p. 101 - 3. Logambal, S.M., Venkatalakshmi, S. and Michel, D.R. 2000. Immunostimulatory effectof leaf extract of Ocimum sanctumLinn. in Oroechromis massambicus (Peters). Hydrobiologia, 430: 113-120. Milla S, Mathieu C, Wang N, Lambet S, Nadzialek S, Kestemont P, et al. Spleenimmune status is affected after acute handling stress but not regulated by cortisol in Eurasian perch,Percafluviatilis. Fish Shellfish Immunol 2010;28:931 - 41 Nguy n oàng Nhật Uyên, uỳnh Kim Ngân, Đặng Thị oàng Oanh và ung Tae Sung (2012). Đáp ng mi n dịch của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). ây ra b i vi khu n d ardsi lla ictalur. Khoa Thủy sản. Đ i học Cần Thơ. Siwicki AK, Anderson DP. An easy spectrophotometric assay for determining total protein and immunoglobulin levels infish sera: correlation tofish health.Tech Fish Immunol 1993;3:23 - 30 Sunyer JO, Tort L. Natural haemolytic and bactericidal activities of sea bream Sparus aurata serum are effected by the alternative complement pathway. Vet Immunol Immunopathol 1995;45:333 - 45. Sajid Maqsood, M.H. Samoon, Prabjeet Singh, 2009. Immunomodulatory and Growth Promoting Effect of Dietary Levamisole in Cyprinus carpioFingerlings Against the Challenge of Aeromonas hydrophila. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 9: 111-120. T Thanh Dung, M. Crumlish, Nguy n Thị Như Ngọc, Nguy n uốc Thịnh và Đặng Thị Mai Thuy, 014. Xác định tác nhân gây bệnh tr ng gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). T p chí khoa học. Đ i học Cần Thơ. 13 -142. 12