Tài liệu ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn bacillus sp chọn lọc lên tăng trưởng luân trùng brachionus plicatilis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHAN THÁI TUYẾT ANH ẢNH HƯỞNG CỦA HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus sp CHỌN LỌC LÊN TĂNG TRƯỞNG LUÂN TRÙNG Brachionus plicatilis LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHAN THÁI TUYẾT ANH ẢNH HƯỞNG CỦA HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus sp CHỌN LỌC LÊN TĂNG TRƯỞNG LUÂN TRÙNG Brachionus plicatilis LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2013 LỜI CẢM TẠ Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành Ts. Phạm Thị Tuyết Ngân, trưởng Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng, là người tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp, và gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc nhất đến Ban Chủ Nhiệm Khoa, cùng quý thầy cô thuộc Khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm vô cùng quý báu trong suốt quá trình học tập và làm luận văn. Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình đã động viên tôi trong suốt thời gian học tập, cảm ơn tập thể lớp Liên Thông K37 đã cùng giúp tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! i THÔNG TIN LUẬN VĂN/LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC, CAO HỌC VÀ NGHIÊN CỨU SINH KHOA THỦY SẢN – TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Tên đề tài Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chọn lọc lên tăng trưởng của luân trùng Brachionus plicatilis Bậc đào tạo Đại học Ngành/Chuyên ngành Nuôi trồng thủy sản Năm 2013 Sinh viên/ học viên/ NCS thực hiện (MSSV) Phan Thái Tuyết Anh/LT11801 Số trang 38 Cán bộ hướng dẫn Ts. Phạm Thị Tuyết Ngân Nguồn kinh phí Tóm tắt Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chọn lọc lên tăng trưởng của luân trùng Brachinonus plicatilis được tiến hành tại khoa thủy sản trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 02 đến tháng 05 năm 2013. Đề tài được thực hiện nhằm năng cao năng suất nuôi luân trùng thông qua việc bổ sung hỗn hợp vi khuẩn cũng như chế phẩm vi sinh vào hệ thống nuôi. Thí nghiệm I, khảo sát ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và chế phẩm vi sinh lên quần thể luân trùng , thí nghiệm được bố trí 3 nghiệm thức: (1) Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn); (2) Bổ sung hỗn hợp vi khuẩn Bacillus B7 + B41 (Bacillus amyloliquefaciens); (3) Bổ sung chế phẩm vi sinh Pro W, mật độ vi khuẩn bổ sung là 107 CFU/mL, chế phẩm vi sinh là 0,5g, thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức có 3 lần lập lại. Mật độ luân trùng ban đầu bố trí là 30 cá thể/mL sau khi quần thể luân trùng đã được vô trùng. Thức ăn cho luân trùng là tảo Chlorella. Thí nghiệm gồm 4 chu kỳ nuôi, mỗi chu kỳ kéo dài 4 ngày, số luân trùng được bố trí cho đầu mỗi chu kỳ là 30 cá thể/mL vào ống falcon. Kết quả cho thấy mật độ độ luân trùng cao nhất là ở nghiệm thức bổ sung hỗn hợp vi khuẩn B7 + B41 vào ngày thứ 4 của chu kỳ 1 (1.000,78 cá thể/mL), mật độ cá thể luân trùng mang trứng cao nhất là ở nghiệm thức B7 + B41 (143,12 cá thể/mL). Mật độ vi khuẩn Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn sẽ thấp hơn so với ở nghiệm thức đối chứng. Thí nghiệm II, nghiên cứu sự biến động mật độ luân trùng sau khi bổ sung vi khuẩn Virio harveyi khi luân trùng đã được bổ sung vi khuẩn Bacillus sp cũng như chế phẩm vi sinh và nghiệm thức đối chứng, mật độ vi khuẩn Vibrio ban đầu là 107 CFU/mL, kết quả ở nghiệm thức đối chứng thì quần thể luân trùng suy tàn nhanh hơn và chết hoàn toàn sau ngày thứ 6 sau khi bổ sung vi khuẩn Vibrio, các nghiệm thức còn lại thì mật độ luân trùng được duy trì với mật độ trung bình là 29,6 cá thể/mL Title: “Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chọn lọc lên tăng trưởng của luân trùng Brachionus plicatilis” ii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ i TÓM TẮT ................................................................................................................ ii MỤC LỤC .............................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. vi DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. vii PHẦN I. GIỚI THIỆU ................................................................................................ 1 1.1. Giới thiệu.......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài............................................................................................ 2 1.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................ 3 2.1. Sinh học và sinh sản luân trùng......................................................................... 3 2.1.1. Cấu tạo....................................................................................................... 3 2.1.2. Vòng đời của luân trùng ............................................................................. 4 2.1.3. Môi trường sống ........................................................................................ 5 2.1.3.1. Nhiệt độ .................................................................................................. 5 2.1.3.2. Độ mặn ................................................................................................... 5 2.1.3.3. pH ........................................................................................................... 5 2.1.3.4. Oxy ......................................................................................................... 6 2.1.3.5. Ánh sáng ................................................................................................. 6 2.1.3.6. NH3......................................................................................................... 6 2.1.3.7. N-NO2..................................................................................................... 6 2.1.4. Dinh dưỡng ................................................................................................ 6 2.2 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus ............................................................................... 7 2.2.1 Vai trò của vi khuẩn Bacillus ...................................................................... 7 2.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus ................................................................ 7 2.2.2.1. Cải thiện sức khỏe ................................................................................... 7 2.2.2.2. Cải thiện môi trường ............................................................................... 8 2.2.2.3. Ức chế tác nhân gây bệnh ....................................................................... 9 iii 2.2.3. Vai trò của Probiotic lên thức ăn tự nhiên ................................................ 10 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ................................... 12 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ...................................................................... 12 3.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 12 3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm ......................................................... 12 3.2.2. Hóa chất................................................................................................... 12 3.2.3. Nguồn nước thí nghiệm............................................................................ 12 3.2.4. Nguồn luân trùng và vi khuẩn Bacillus .................................................... 12 3.2.5. Nguồn thức ăn ......................................................................................... 13 3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 13 3.3.1. Phương pháp xác trùng luân trùng để tạo con non vô trùng ...................... 13 3.3.2. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 14 3.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................ 14 3.3.3.1. Chỉ tiêu môi trường ............................................................................... 14 3.3.3.2. Chỉ tiêu vi khuẩn ................................................................................... 15 3.3.3.3. Chỉ tiêu sinh học ................................................................................... 15 3.4. Phương pháp thu thập, tính toán và xử lý số liệu ............................................. 15 3.4.1. Chỉ tiêu môi trường .................................................................................. 15 3.4.2. Chỉ tiêu vi khuẩn ...................................................................................... 15 3.4.2.3. Phương pháp xác đinh mật độ vi khuẩn Bacillus sp. .............................. 16 3.4.2.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn tổng và vi khuẩn Vibrio ........... 16 3.4.2.5. Xác định mật độ vi khuẩn trong chế phẩm vi sinh ................................. 16 3.4.3. Chỉ tiêu sinh học ...................................................................................... 17 3.4.4. Xử lý số liệu ............................................................................................ 17 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 18 4.1 Thí nghiệm I: Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus lên sự tăng trưởng của quần thể luân trùng ................................................................................................ 18 4.1.1 Biến động các yếu tố môi trường .............................................................. 18 4.1.1.1 Nhiệt độ ................................................................................................. 18 iv 4.1.1.2 Giá trị pH ............................................................................................... 18 4.1.1.3 Nitrite (NO2-) ......................................................................................... 19 4.1.1.4 Ammonia tổng cộng (TAN) ................................................................... 20 4.1.2 Biến động mật độ vi khuẩn ....................................................................... 21 4.1.2.1 Biến động mật độ vi khuẩn tổng cộng .................................................... 21 4.1.2.2 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus ....................................................... 21 4.1.2.3 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio .......................................................... 22 4.1.3 Sự phát triển của luân trùng ...................................................................... 23 4.1.3.1 Biến động mật độ luân trùng .................................................................. 23 4.1.3.2 Biến động mật độ luân trùng mang trứng ............................................... 24 4.2 Thí nghiệm 2: Biến động mật độ luân trùng sau khi bổ sung vi khuẩn Virio harveyi (cá thể/mL) ............................................................................................... 25 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................................... 27 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 27 5.2 Đề xuất ............................................................................................................ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 28 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 31 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Môi trường sống của luân trùng .............................................................. 5 Bảng 4.2: Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trước và sau khi bổ sung .................. 25 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Đặc điểm cấu tạo của Brachionus plicatilis .............................................. 3 Hình 2.2: Vòng đời của luân trùng........................................................................... 4 Hình 4.1 Biến động nhiệt độ trong thí nghiệm ...................................................... 18 Hình 4.2 Biến động pH trong thí nghiệm ............................................................... 19 Hình 4.3 Biến động NO2- trong thí nghiệm ........................................................... 19 Hình 4.4 Biến động TAN trong thí nghiệm............................................................ 20 Hình 4.5 Biến động mật độ vi khuẩn tổng cộng trong thí nghiệm .......................... 21 Hình 4.6 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus ........................................................ 22 Hình 4.7 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong thí nghiệm ................................ 23 Hình 4.8 Biến động mật độ luân trùng trong thí nghiệm ........................................ 24 Hình 4.9 Biến động mật độ luân trùng mang trứng trong thí nghiệm ..................... 25 Hình 4.10 Biến động mật đô luân trùng khi gây cảm nhiễm với Vibrio harveyi ..... 26 vii PHẦN I. GIỚI THIỆU 1.1. Giới thiệu Trong sản xuất giống thì thức ăn và kỹ thuật cho ăn trong khi ương ấu trùng là vấn đề rất quan trọng vì vậy thức ăn tự nhiên đóng vai trò rất quan trọng quyết định sự thành công trong ương nuôi nhiều loài động vật thủy sản (Trần Thị Thanh Hiền và ctv., 2007). Luân trùng nước lợ (Brachionus plicatilis) được nuôi và sử dụng trong sản xuất giống của hơn 60 loài cá biển và 18 loài giáp xác (Nagata, 1989). Nhờ có kích thước nhỏ, bơi lội chậm chạp, sống lơ lững trong nước làm cho luân trùng trở thành con mồi thích hợp cho ấu trùng các loài cá và giáp xác biển có kích thước miệng nhỏ (Snell và Carrillo, 1984). Hơn nữa, do đặc điểm ăn lọc không chọn lọc nên luân trùng có thể được giàu hoá bằng các chất dinh dưỡng cần thiết hay kháng sinh để đưa vào cơ thể ấu trùng nuôi (Lubzens et al., 1989). Vì vậy, luân trùng đã trở thành nguồn thức ăn tươi sống không thể thiếu trong sản xuất giống của nhiều loài giáp xác và cá biển. Các nhà nghiên cứu từ lâu đã quan tâm đến việc nghiên cứu đặc điểm sinh học, kỹ thuật nuôi một số loại thức ăn tươi sống cho ấu trùng động vật thủy. Quan tâm các đối tượng chủ yếu như: vi tảo, luân trùng, giáp xác râu ngành, Artemia, trùng chỉ (Trần Thanh Hiền và ctv., 2007). Nhật Bản là nơi đầu tiên thực hiện nghiên cứu nuôi sinh khối luân trùng vào năm 1964 (Hirata, 1979; trích từ Trần Công Bình, 2006). Ở Trung Quốc năm 1980 các nghiên cứu về luân trùng làm thức ăn cho ấu trùng cá biển được tiến hành (Chen, 1991; trích dẫn từ Trần Thị Thanh Hiền và ctv, 2007). Ở Hoa Kỳ, năm 1971 Theilaccker và McMaster đã công bố lần đầu tiên kết quả nghiên cứu về Brachionus plicatilis là thức ăn tuyệt vời cho ấu trùng cá biển (Wendy và Kenvan, 1991). Tuy nhiên, đến nay thì luân trùng vẫn được nuôi ở qui mô thí nghiệm, chủ yếu phục vụ cho ương nuôi các loài Mullet, cá măng, Pacific threatfin và mahimah, Red drum, cá chẽm trắng và California halibut. Sản lượng nuôi mỗi ngày thường đạt 100-500 triệu con, năng suất trung bình 25,7-75 cá thể/ml/ngày. Hino (1991) cho rằng sự thay đổi của quần thể vi khuẩn hay bị nhiễm của các loài khác sẽ ảnh hưởng đến quá trình nuôi luân trùng. Các loại vi khuẩn trong bể nuôi luân trùng phát triển sẽ có những ảnh hưởng có lợi hay có hại tùy thuộc vào loại vi khuẩn. Nhằm tìm hiểu và đánh giá khả năng ảnh hưởng của vi khuẩn đến quá trình nuôi luân trùng, đề tài “Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chọn lọc lên tăng trưởng của luân trùng Brachionus plicatilis” được thực hiện. 1 1.2. Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu và đánh giá ảnh hưởng của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp chọn lọc lên tỷ lệ sống, tỷ lệ mang trứng của quần thể luân trùng nước lợ Brachionus plicatilis, đồng thời kiểm tra chất lượng nước trong quá trình nuôi. 1.3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn có lợi B7, B41 (Bacillus amyloliquefaciens) lên tỷ lệ sống, tỷ lệ tăng trưởng của luân trùng. Đồng thời xác định tỷ lệ sống của luân trùng thông qua thí nghiệm gây cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio harveyi. 2 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sinh học và sinh sản luân trùng 2.1.1. Cấu tạo Kích thước của luân trùng Brachionus plicatilis từ 100 – 340 µm (Dhert, 1996), dạng hình trứng dài, hơi dẹp theo hướng lưng bụng. Bờ bụng trước có 4 gai u dạng lồi. Cấu tạo và hình thái của luân trùng được Ruttner – Kolisko mô tả năm 1994 (Rombaut, 2001). Luân trùng gồm có 3 phần: đầu, thân và chân. Đầu có vòng tiêm mao như bánh xe giúp di chuyển, thân có ống tiêu hóa: Nhờ vòng tiêm mao mà luân trùng thu được thức ăn sau đó vào trong miệng và đến hàm nghiền. Có nhiều cách khác nhau để hàm nghiền nghiền các hạt thức ăn (cắt, nghiền…) rồi đi vào thực quản, dạ dày, ruột và hậu môn (Nogrady, 1993), hệ bài tiết: Luân trùng bài tiết chủ yếu là chất thải có nguồn gốc đạm (phần lớn là ammonia). Tiêm mao chuyển động ở các tế bào ngọn lửa (flame cells) tạo nên dòng chảy nhỏ các chất lỏng bài tiết vào trong các túi và chảy vào bàng quang sau đó được bài tiết ra ngoài thường xuyên và đều đặn (Nogrady, 1993), và hệ sinh dục: Cơ quan sinh dục của con cái bao gồm 3 phần: buồng trứng, chất noãn hoàng và lớp nang. Từ khi mới sinh ra, số lượng trứng đã có sẳn trong buồng trứng. Luân trùng có bộ phận nghiền thức ăn, chân có dạng vòng đàn hồi, không đốt, có 1 hay 4 ngón. Có khoảng 1000 tế bào. Do nguyên sinh chất tăng lên mà cơ thể lớn lên, không phải do sự phân chia của tế bào. Con đực không có cơ quan tiêu hóa và có kích thước nhỏ hơn con cái. Ở con đực cơ quan dao cấu chứa đầy tinh dịch. Con cái gồm hai dạng là con cái đơn tính và con cái hữu tính. Hình 2.1: Đặc điểm cấu tạo của Brachionus plicatilis (Dhert, 1996) Luân trùng gồm có hai dòng được sử dụng phổ biến là Brachionus plicatilis (L – type) kích cở 130 – 340 µm và Brachionus plicatilis (S – type) có kích cỡ 100 – 210 µm. 3 2.1.2. Vòng đời của luân trùng Luân trùng có tuổi thọ ngắn, trung bình 3,4 – 4,4 ngày ở điều kiện nhiệt độ 25°C. Chúng có thể đạt đến giai đoạn trưởng thành chỉ 0,5 – 1,5 ngày sau khi nở hay đẻ. Sau đó, con cái có thể đẻ liên tục, mỗi lần cách nhau khoảng 4 giờ. Suốt vòng đời con cái có thể tham gia đẻ 10 lứa. Với tốc độ sinh sản nhanh và có thể nuôi đạt mật độ rất cao 20.000 con/mL (Suantika, 2001, trích dẫn theo Ngô Thị Huyền, 2011). Tuy nhiên, khả năng sinh sản của con cái còn tùy thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường, đặc biệt là nhiệt độ. Luân trùng kiểu S – type và L – type sinh trưởng với tốc độ khác nhau, có khả năng chịu đựng nhiệt độ khác nhau và có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu khác nhau. Kiểu S – type và L – type sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ lần lượt từ 28 – 350C và 18 – 250C (Duhert, 1996, trích dẫn theo Nguyễn Văn Hạnh, 2007). Hình 2.2: Vòng đời của luân trùng (Dhert, 1996) Có sự luân phiên giữa hai hình thức sinh sản của vòng đời luân trùng: đơn tính và lưỡng tính. Ở điều kiện thích hợp, con cái lưỡng tính (2n) sinh sản chủ yếu đơn tính và đẻ trứng nhiều đợt, mỗi lần cho 1 – 2 trứng 2n có kích cỡ (80 – 100) × (110 – 130) µm. Sau này các trứng sẽ nở thành con cái 2n. Con cái này lại tiếp tục vòng đời sinh sản bằng hình thức đơn tính như trên. Ở điều kiện môi trường trở nên bất lợi chúng sẽ hình thành trứng nghĩ bằng hình thức sinh sản hữu tính để chịu đựng qua điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Do đó, trong thực tế người ta có thể chủ động tạo điều kiện cho luân trùng sinh sản đơn tính hay hữu tính tùy nhu cầu (Dhert, 1996). 4 2.1.3. Môi trường sống Theo Fulks và Main (1991, trích dẫn theo Nguyễn Văn Hạnh, 2007) thì luân trùng có môi trường sống rất rộng, thể hiện ở Bảng 2.1 Bảng 2.1: Môi trường sống của luân trùng (Fulks và Main, 1991) Chỉ tiêu Nhiệt độ (0C) Khoảng cho phép Khoảng thích hợp 20 – 30 21 – 25 Oxy hòa tan (ppm) NH3-NH4+ (ppm) 2–7 6 - 10 NH3 (ppm) Nồng độ muối (ppt) <1 1 – 60 20 (S-type), 30 (L-type) Cường độ ánh sáng (lux) 2.000 Chu kỳ sáng: tối 18 : 6 pH 5 – 10 7.5 – 8.5 2.1.3.1. Nhiệt độ Ở luân trùng thì nhiệt độ dựa và hình thái của chúng. Ở nhiệt độ 18 - 25°C luân trùng dòng L sẽ phát triển tốt nhất, dòng S lại thích hợp với nhiệt độ là 28 - 35°C, nhưng nhiệt độ dao động thích hợp cho luân trùng là 20 - 30°C (Fulks và Main, 1991). Nhiệt độ thấp dưới 100C luân trùng sẽ hình thành trứng nghỉ và quần thể tàn lụi (Fukusho, 1989a; trích từ Fulks và Main, 1991). Khả năng tiêu thụ thức ăn của luân trùng và thành phần sinh hóa cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Luân trùng tiêu hóa carbohydrate và chất béo dự trữ rất nhanh ở nhiệt độ cao (Dhert, 1996). 2.1.3.2. Độ mặn Brachionus plicatilis là loài rất rộng muối, độ mặn mà chúng có thể chịu đựng được dao động trong khoảng 1 – 67 ppt (Hoff và Snell, 1989), tuy nhiên ở độ mặn dưới 35‰ chúng có thể sinh sản tối ưu (Lubzen, 1987). Sự tăng trưởng của luân trùng ở độ mặn tốt nhất từ 10 – 20 ppt (Hoff và Snell, 1989). Luân trùng loại nhỏ (S – type) sinh trưởng tốt nhất ở độ mặn 20‰ và loại lớn (L – type) tốt nhất là 30‰. Luân trùng sống rộng muối, nhưng để nuôi luân trùng với độ mặn thích hợp cần chú ý đến độ mặn nước ương ấu trùng tôm cá, không để độ mặn có sự chênh lệch quá lớn (trên 5ppt) giữa nước nuôi luân trùng và nước ương ấu trùng tôm cá vì nó có thể gây sốc, giảm bơi lội hay giảm hoạt động của luân trùng (Dhert, 1996). 2.1.3.3. pH Trong tự nhiên, luân trùng có thể sống ở pH từ 5 – 10, thích hợp nhất ở 7,5 - 8,5 (Hoff và Snell, 2004). pH từ 6,5 - 8,5 thì hoạt động bơi lội và hô hấp của luân trùng không thay đổi và khi giảm pH dưới 5,6 hoặc trên 8,7 (Nogrady 1993). Tùy theo dòng luân 5 trùng mà có phạm vi pH tối ưu cũng khác nhau, hoạt động bơi lội của luân trùng trong môi trường kiềm giảm nhanh hơn trong môi trường acid, pH có ảnh hưởng gián tiếp đến luân trùng qua nồng độ ion amonia. Khoảng pH thích hợp có thể phụ thuộc vào thức ăn (Furukawa và Hidaka, 1973 trích bởi Fulks, 1991). 2.1.3.4. Oxy Oxy dưới 2 ppm luân trùng có khả năng chịu đựng được. Tùy vào nhiệt độ, độ mặn, loại thức ăn, mật độ thức ăn và mật độ luân trùng mà nồng độ oxy trong bể nuôi sẽ thay đổi rất lớn. Nhu cầu tiêu thụ oxy sẽ phụ thuộc vào từng loại thức ăn và nhiệt độ (Fulks và Main, 1991). Để đảm bảo đủ oxy cho luân trùng trong quá trình nuôi cần sục khí với tốc độ 60 – 100 lít/phút/m3. 2.1.3.5. Ánh sáng Khi so sánh hệ thống nuôi ngoài trời với ánh sáng mặt trời đầy đủ và nuôi trong điều kiện tối Fukusho (1989) nhận thấy luân trùng Brachionus plicatilis phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng đầy đủ. Theo Fulks và Main (1991) ánh sáng kích thích sự phát triển của luân trùng nhờ vào sự gia tăng phát triển của vi khuẩn quang hợp và tảo trong bể nuôi. 2.1.3.6. NH3 NH3 là chất gây độc đối với động vật thủy sinh. pH và nhiệt độ có ảnh hưởng đến hàm lượng N – NH3. Fulks và Main (1991) đã nêu ra mối quan hệ giữa hàm lượng NH3 và mật độ luân trùng thấp trong bể nuôi luân trùng. Họ cũng đã điều tra về ảnh hưởng tức thời và lâu dài của NH3 đến tốc độ phát triển và sinh sản của luân trùng, đi đến kết luận “NH3 là một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển quần thể trong hệ thống nuôi luân trùng”. Hoff và Snell (2004) đề nghị hàm lượng NH3 không nên vượt quá 1 ppm trong bể nuôi luân trùng. Sức sinh sản và tốc độ tăng trưởng của quần thể sẽ giảm 50% khi NH3 ở nồng độ 8 – 13 ppm (Fulks và Main, 1991). 2.1.3.7. N-NO2 Theo Groeneweg và Schluter (1981) đối với luân trùng Brachionus plicatilis thì hàm lượng N – NO2- từ 10 – 20 ppm sẽ không gây độc. Lubzens (1987) Nồng độ N – NO2gây độc đối với luân trùng từ 90 – 140 ppm. 2.1.4. Dinh dưỡng Luân trùng là loại ăn lọc không chọn lọc, thức ăn có kích thước 20 – 25 µm mang đến miệng nhờ sự chuyển động của vòng tiêm mao thông qua hoạt động bơi lội (Dhert, 1996). Theo James và ctv (1983) cho luân trùng ăn bằng vi tảo sẽ tăng năng suất nuôi, trong đó luân trùng phát triển tốt khi sử dụng các loài tảo Chlorella, Nannochloropsis oculata, Isochrysis, Tetraselmis… Theo Nagata và Whyte (1992) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại thức ăn khác nhau đến sự phát triển của luân trùng, tác giả 6 nhận thấy luân trùng khi sử dụng Chlorella sacchrophila có tốc độ sinh sản và đạt mật độ cao nhất, kế đến là Isochrysis, Tetraselmis suecica, men bánh mì Saccharomyces cereviciae và cuối cùng là Thalassiosira pseudonana. Điều này cũng phù hợp với nhận định của Liao và ctv (1983) thức ăn tốt nhất cho sự phát triển của luân trùng là Chlorella nước mặn. Một trong những thuận lợi trong việc sử dụng Chlorella làm thức ăn cho luân trùng là do tảo này phát triển và phân cắt nhanh (chỉ sinh sản vô tính). Chlorella chứa hàm lượng protein 50%, lipid 20%, Carbohydrate 20%, Vitamin B1, B12, chất khoáng… Hơn nữa Chlorella còn sản sinh ra chất kháng sinh Chlorellin kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh (Sharma, 1998). Ngoài ra luân trùng còn có khả năng ăn nhiều loại thức ăn khác như men, bột đậu nành, thức ăn nhân tạo. Giá trị dinh dưỡng của thức ăn sẽ quyết định đến giá trị dinh dưỡng của luân trùng. 2.2 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus 2.2.1 Vai trò của vi khuẩn Bacillus Giống Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào. Bacillus được tìm thấy gần 500 loài, là vi khuẩn hình que, gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, tất cả đều hình thành nội bào tử. Do sự đa dạng sinh thái và loài nên các hoạt chất của chúng cũng rất phong phú. Triển vọng ứng dụng Bacillus trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus như: B. subtilis, B. Aterrimus, B. niger, B. pumilis, B. panis, B. vulgarus, B. nigrificans, B. natto, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. mesentericus… đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò cải thiện sức khỏe, tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường. Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (Vibrio) giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này. 2.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus 2.2.2.1. Cải thiện sức khỏe - Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa: Cung cấp dinh dưỡng trực tiếp: một số nghiên cứu trên các đối tượng nuôi thủy sản như: luân trùng, Artemia, nhuyễn thể, ấu trùng giáp xác, cá… cho thấy Bacillus đã trực tiếp cung cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi đặc biệt là acid béo và vitamin. Một nghiên cứu khác trên cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelinus alpinus L) kết quả cũng cho thấy vi khuẩn có thể đã có vai trò quan trọng trong quá trình dinh dưỡng của cá. Nghiên cứu tương tự trên tôm thẻ trưởng thành (Penaeus chinensis) cho thấy hệ vi sinh vật đã cung cấp nguồn dinh dưỡng và là nguồn thức ăn trực tiếp cho tôm. Vì vậy, 7 ứng dụng vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản thường cho kết quả cao về tỉ lệ sống, tăng trưởng và hiệu quả kinh tế. Hỗ trợ tiêu hóa: vài loài vi khuẩn đã được nghiên cứu trên động vật hai mảnh vỏ cho thấy vi khuẩn còn góp phần hỗ trợ tiêu hóa do chúng sản sinh các enzyme như proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn. - Tăng cường các phản ứng miễn dịch Vi khuẩn có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Một nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng hoạt động thực bào của bạch cầu. Một nghiên cứu khác của Rengpipat et al., (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã tiết ra các chất làm tăng đáp ứng cả miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcázar (2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V. harveyi và virus đốm trắng. Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei et al., (2009) trộn B. subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B. subtilis cũng tăng nhanh trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm. 2.2.2.2. Cải thiện môi trường - Phân hủy các chất thải: Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như carbonhydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm. Bacillus có tác dụng làm giảm COD, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi. Do nhóm vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn vi khuẩn gram (+) thường phân hủy vật chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn nhóm gram (-). Urê và axit uric có trong thành phần chất thải của động vật nuôi thủy sản. Quá trình amôn hóa urê trãi qua 2 giai đoạn, urê sẽ bị thủy phân tạo thành muối carbonate amôn. Ở giai đoạn 2, carbonate amôn chuyển hóa thành NH3, CO2 và H2O. Axit uric bị các vi sinh vật phân giải thành urê và acid tactronic. Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH3. Bacillus tham gia trong quá trình amôn hóa protein là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ, giải phóng NH3. Ban đầu protein bị phân cắt thành pepton, polypeptid oligopeptid, dipeptid và acid amin. Một phần axit amin sẽ được tế bào Bacillus hấp thu làm chất dinh dưỡng, phần khác sẽ thông qua quá trình khử amin tạo thành NH3 và nhiều sản phẩm trung gian khác tùy theo điều kiện. Sản phẩm cuối cùng chủ yếu của quá trình vô cơ hóa hiếu khí protein là ammonia, carbonic, các muối của acid sulfuric và acid phosphoric. - Giảm chất độc NH3, H2S: 8 Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bên cạnh NH3 và CO2 còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như acid hữu cơ, rượu, H2S và những dẫn suất của nó như mecaptan, các chất độc như diamin và tomain, indon và scaton. Đây là lý do người nuôi luôn phải duy trì hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao luôn cao để đảm bảo quá trình phân hủy hữu cơ xảy ra hoàn toàn. Ứng dụng Bacillus trong trường hợp này làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ tránh đáy ao, làm giảm các chất dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy ao. 2.2.2.3. Ức chế tác nhân gây bệnh - Tiết ra kháng sinh: Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn có thể tiết vào môi trường chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh khác. Mục đích gián tiếp là cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường. Nghiên cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của B. subtilis đã được ghi nhận hơn 50 năm qua. Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn B. subtilis có khả năng tiết ra hơn 20 chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau. Bao gồm: subtilin, ericin, mersacidin, sublancin, subtilosin, surfactin, iturin, bacillibactin, bacillmycin, mycosubtilin, fengycin, plipastatin, corynebactin, bacilysin, difficidin, oxydifficicin, bacilysocin, rhizocticin, amicoumacin, mysobaccillin... Hầu hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của vi khuẩn cơ hội gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Các chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn lẻ hoặc kết hợp nhau. - Cạnh tranh dinh dưỡng: Sự cạnh tranh chủ yếu xảy ra ở nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cạnh tranh cơ chất hữu cơ, là nguồn carbon và năng lượng. Những nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này chưa nhiều. Rico-Mora (1998), đã đưa một dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ. Cấy vi khuẩn này vào bể nuôi tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus, kết quả Vibrio không phát triển. Điều này chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ. Verschuere et al., (1999) đã chọn lọc vài dòng vi khuẩn có ảnh hưởng tốt đến tỉ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia để làm thí nghiệm. Những vi khuẩn này được đưa vào môi trường nuôi Artemia sau khi nước nuôi đã được lọc sạch. Kết quả cho thấy chất kìm hãm được tiết ra môi trường có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh V. proteolytics CW8T2. Vì vậy, những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng lượng và chất dinh dưỡng. - Cạnh tranh chất sắt: Tất cả các vi sinh vật đều cần chất sắt cho sinh trưởng (Reid et al., 1993). Hiện tượng siderophores là hiện tượng vi khuẩn tiết ra chất kết tủa các ion sắt có trọng lượng phân tử thấp trong môi trường. Các vi sinh vật này sẽ hấp thu các phân tử Fe kết tủa này và 9 làm mất Fe trong môi trường. Các vi sinh vật gây bệnh cần nhiều sắt để tăng trưởng, do vậy dẫn đến hiện tượng cạnh tranh Fe của vi sinh vật trong thủy vực, kết quả làm hạn chế mầm bệnh trong môi trường (Neilands, 1981; Wooldridge et al., 1993). Tóm lại, các chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus có thể góp phần làm giảm rủi ro do dịch bệnh nhờ vào khả năng giúp cải thiện sức khỏe của tôm cá, cải thiện môi trường và ức chế tác nhân gây bệnh trong ao nuôi. 2.2.3. Vai trò của Probiotic lên thức ăn tự nhiên Probiotic được định nghĩa như là một vi sinh vật được bổ sung vào để mang lại những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ bởi khả năng tăng cường mối quan hệ đối với vật chủ hoặc là mối quan hệ giữa vật chủ với cộng đồng vi sinh vật xung quanh, làm tăng cường giá trị của dinh dưỡng, tăng cường khả năng phản ứng của vật chủ đối với bệnh tật, hoặc cải thiện môi trường sống xung quanh. Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu về probiotic được thực hiện trên nhóm cá, nhóm giáp xác, nhuyễn thể và thức ăn tự nhiên. Sự hình thành cộng đồng vi sinh vật trên cá và nhóm giáp xác, nhuyễn thể ở giai đoạn ấu trùng là một giai đoạn chuyển tiếp và phản ánh hệ vi sinh vật tồn tại trên trứng, môi trường nước nuôi và hệ vi sinh vật trong thức ăn tự nhiên (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv, 2010). Hiện nay trong thủy sản người ta đã phân lập và định danh được nhiều loại probiotic – lactic như Carnobacterium piscicola (Hius, 1984), Lactobacillus plantarum (Schroder, 1984), Pediococcus acidilactici (Pucci, 1988 ). Các chủng vi khuẩn này có khả năng sống trong môi trường có sự dao động mạnh về nhiệt độ và pH. Chúng chịu mặn, chịu kiềm đồng thời tổng hợp các hợp chất kháng sinh tương ứng như: piscicolin, plantarin, pediococin (PA - 1) có tính sát khuẩn cao, đặc biệt đối với vi khuẩn gây bệnh như: Listeria monocytogenes (Pucci, 1988), Shigella spp. và Salmonella spp.. Trong những năm gần đây có khá nhiều công trình tổng quan về tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản, những nghiên cứu probiotic trong thời gian gần đây đã chú ý nhiều hơn đến ứng dụng cho ấu trùng cá và giáp xác và cho thức ăn tự nhiên, đặc biệt tác động của probiotic đối với các loại thức ăn tự nhiên như tảo đơn bào, luân trùng và Artemia. Tảo đơn bào: Tảo có khả năng tăng trưởng nhờ một số dòng vi khuẩn (Fukami et al., 1997, Munro et al., 1995, Sumintoc and Hirayama, 1997). Vi sinh vật hữu ích sử dụng cho ương ấu trùng trong đó có thể sử dụng tảo hay dùng nước xanh cần phải đánh giá tác động đối với tảo. Tác động tăng năng suất tảo là do khả năng chống lại sự cảm nhiễm vi khuẩn có hại cho tảo và chuyển hóa nhanh các vật chất hữu cơ (ở hàm lượng thấp) thành vô cơ (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010). Không những thế vi khuẩn có lợi sẽ kích thích sự phát triển của tảo qua việc phân hủy xác tảo chết tạo thành các dạng amon (NH3, NH4+) cung cấp nguồn dinh dưỡng cho 10 tảo hấp thu. Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp Vitamin B đặc biệt là B12 là thành phần vi lượng cần thiết cho tảo phát triển (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010). Artemia: Trong nuôi Artemia sinh khối có nhiều loài vi khuẩn được phân lập giúp tăng năng suất nuôi Artemia. Các vi khuẩn này có khả năng giúp Artemia chống lại vi khuẩn gây bệnh, giảm tỷ lệ tử vong trong thí nghiệm cảm nhiễm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh (Verschuere et al., 1999; Gomez-Gil et al., 1998). Luân trùng: Nhiều dòng vi khuẩn cũng được phân lập và có tác dụng tăng năng suất nuôi luân trùng. Các nghiên cứu chủ yếu dựa trên tác động dinh dưỡng của vi khuẩn đến vật nuôi. Cơ chế của quá trình kích thích tăng trưởng này là rất khác nhau: Kích thích quá trình sinh sản vô tính, làm thức ăn trực tiếp hoặc tăng cường hấp thu dinh dưỡng (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010). Một số dòng vi khuẩn có tác dụng kích thích sự tiêu hóa, hoặc kích thích sinh trưởng của luân trùng khi cho chúng ăn (Nguyễn Thị Tú Anh, 2004). Theo tổng hợp của Gomez - Gil (2003), những dòng vi khuẩn đã được nhận dạng trong nuôi luân trùng là Pseudomonas, Vibrio, Moraxella và Flavobacterium (Verdonck et ali., 1994, 1997); Vibrio là dòng chiếm ưu thế trong nuôi luân trùng, chiếm trên 56% quần thể vi khuẩn với V. Anguillarum, V. Alginolyticus, V. Diazotrophicus, V. Mediterrianei và V. Tubiashii (Verdonck et al, 1997). Gracia et al., (1992) thêm vi khuẩn lactic acid (Streptococus lactis và Lactobacillus bulgaricus) vào luân trùng (Brachionus) và Artemia, sau đó dùng luân trùng làm thức ăn cho cá bơn trong những ngày đầu cho ăn. Kết quả sau một lần thí nghiệm (không lặp lại), tỉ lệ sống đạt 55% vào ngày thứ 17 khi cho ăn nhóm vi khuẩn lactic acid sống vào; 66% với nhóm vi khuẩn làm yếu đi và 34% nhóm đối chứng. Theo Nair et al., 1985 vi khuẩn lactic acid và một số nhóm vi khuẩn khác có khả năng tiết ra chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus. Sử dụng các nhóm vi khuẩn có lợi phân lập từ ruột cá bơn (Scophthalmus maximus) trong ao nuôi có thể kìm hãm vi khuẩn Vibrio anguillarum gây bệnh (Olsson et al., 1992), điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn có lợi đã cạnh tranh có hiệu quả với nhóm vi khuẩn gây bệnh (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). 11