Tài liệu ảnh hưởng của bổ sung các chủng vi khuẩn bacillus sp. khác nhau trong nuôi tôm thẻ chân trắng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HUỲNH PHONG ĐẠI ẢNH HƯỞNG CỦA BỔ SUNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS sp. KHÁC NHAU TRONG NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HUỲNH PHONG ĐẠI ẢNH HƯỞNG CỦA BỔ SUNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS sp. KHÁC NHAU TRONG NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2013 LỜI CẢM TẠ Cảm ơn các quý Thầy Cô và các anh chị trong Thư viện khoa thủy sản, Trung tâm học liệu, phòng thí nghiệm phân tích chất lượng nước, Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho trong thời gian làm luận văn. Xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã dành thời gian tận tình hướng dẫn, động viên, cung cấp nhiều kiến thức quý báo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Xin cảm ơn Nguyễn Tấn Cường đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi vô cùng biết ơn gia đình và những người thân của tôi đã chia sẻ, động viên và dành những gì tốt đẹp nhất cho tôi có được thành công như ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện Huỳnh Phong Đại i TÓM TẮT Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và chất thải của tôm đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn và nghiệm thức đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Mục đích nhằm theo dõi và đánh giá chất lượng nước, vật chất hữu cơ trong ao có bổ sung vi khuẩn Bacillus. Các chỉ tiêu chất lượng nước như nhiệt độ, pH, DO, COD, TSS, TAN và tổng độ kiềm. Mẫu được thu trước khi bổ sung vi khuẩn, thu định kì 5 ngày/lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm (60 ngày). Phương pháp thu và phân tích mẫu dựa theo phương pháp chuẩn (APHA, 2005), đang được áp dụng tại phòng phân tích chất lượng nước, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. Kết quả sau 12 đợt thu mẫu cho thấy các yếu tố như nhiệt độ, pH, tổng độ kiềm ít biến động và nằm trong khoảng cho phép. Các yếu tố khác như DO, COD, TSS, TAN có sự biến động giữa các nghiệm thức và có xu hướng tăng về cuối thí nghiệm. Tuy nhiên vẫn ở mức thích hợp cho tôm nuôi. Mật độ tổng vi khuẩn và Vibrio ở nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn luôn thấp hơn nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn. Tỉ lệ sống của tôm nuôi thí nghiệm đạt cao ở nghiệm thức B2 (70.0±5.3%) và nghiệm thức B41 (86.7±3.1%), khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng (65.3±3.1%). Từ khóa: chất lượng nước, chế phẩm vi sinh, tổng vi khuẩn, Vibrio, Bacillus, tôm thẻ chân trắng. ii MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... iii CHƯƠNG 1 ................................................................................................................. v ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1 1.1 Giới thiệu ............................................................................................................... 1 1.2Mục tiêu của đề tài: ................................................................................................. 2 1.3 Nội dung của đề tài: ............................................................................................... 2 1.4 Thời gian thực hiện đề tài: ..................................................................................... 2 CHƯƠNG 2 ................................................................................................................. 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................................ 3 2.1 Tình hình nghiên cứu các dòng vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản ................................................................................................................................ 3 2.2 Khái quát về vi khuẩn Bacillus và tôm thẻ chân trắng ........................................... 4 2.2.1 Vi khuẩn Bacillus ............................................................................................ 4 2.2.1.1 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản.......................... 4 2.2.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản ..................... 4 2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản ........................ 7 2.3.1 Sơ lược về probiotic ........................................................................................ 7 3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản .................................. 8 2.4 Sự siến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi thuỷ sản. ................................. 9 2.4.1 Nhiệt độ ........................................................................................................... 9 2.4.2 pH .................................................................................................................... 9 2.4.3 TSS .................................................................................................................. 9 2.4.4 Oxy hòa tan (DO – Dissolved Oxygen) ........................................................ 10 2.4.5 Tiêu hao oxy hóa học (COD – Chemical Oxygen Demand) ........................ 10 2.4.6 Ammonia tổng cộng (TAN - Total Ammonia Nitrogen) .............................. 10 2.4.7 Độ kiềm tổng cộng ........................................................................................ 11 CHƯƠNG 3 ............................................................................................................... 12 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 12 3.1.1 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 12 3.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi......................................................................... 12 3.1.3 Nguồn vi khuẩn, tôm thẻ chân trắng, bể composite và nguồn nước. ............ 12 3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 13 iii 3.2.1 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 13 3.2.2 Phương pháp pha loãng mẫu ......................................................................... 13 3.2.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn ........................................................... 14 3.2.4 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước ...................................................... 14 3.2.5 Phương pháp xác định mật độ tổng vi khuẩn Bacillus .................................. 14 3.2.6 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm ................................................ 13 3.2.7 Tính tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm. ............................................. 15 3.3 Phương pháp thu và phân tích các chỉ tiêu........................................................... 15 3.4 Phương pháp tính toán và xử lí số liệu................................................................. 16 CHƯƠNG 4 ............................................................................................................... 17 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................... 17 4.1. Biến động một số chỉ tiêu môi trường nước ....................................................... 17 4.1.1. Nhiệt độ ........................................................................................................ 17 4.1.2. pH ................................................................................................................. 17 4.1.3. Tổng độ kiềm ............................................................................................... 18 4.1.4. Tổng vật chất lơ lửng (TSS) ......................................................................... 19 4.1.5. Sự biến động Oxy hòa tan (DO) .................................................................. 20 4.1.6 Tiêu hao oxy hóa học (COD) ........................................................................ 20 4.1.7. Tổng đạm amon (TAN)................................................................................ 21 4.2. Biến động một số vi khuẩn trong nước ............................................................... 22 4.2.1. Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus ............................................................ 22 4.2.2. Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio ............................................................... 23 4.2.3. Biến động mật độ tổng vi khuẩn .................................................................. 24 4.3. Tốc độ tăng trưởng về chiều dài và trọng lượng của tôm ................................... 25 4.3.1. Trọng lượng.................................................................................................. 25 4.3.2. Tỉ lệ sống tôm nuôi ...................................................................................... 26 4.4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................ 27 4.4.1.Kết luận ......................................................................................................... 27 4.4.2 Đề xuất .......................................................................................................... 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 28 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1 Phương pháp thu và phân tích các chỉ tiêu ....................................... 16 Hình 4.1 Sự biến động nhiệt độ trong ngày của các nghiệm thức ................... 17 Hình 4.2 Sự biến động pH trong ngày của các nghiệm thức ........................... 18 Hình 4.3 Sự biến động của độ kiềm tổng cộng trong thời gian thu mẫu ......... 19 Hình 4.4 Sự biến động của tổng vật chất lơ lửng trong thời gian thu mẫu ..... 20 Hình 4.5 Sự biến động của oxy hòa tan trong thời gian thu mẫu .................... 20 Hình 4.6 Sự biến động của COD trong thời gian thu mẫu .............................. 21 Hình 4.7 Sự biến động của TAN trong thời gian thu mẫu............................... 22 Hình 4.8 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong nước .............................. 23 Hình 4.9 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước ................................. 24 Hình 4.10 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước .................................. 25 Hình 4.11 Tốc độ tăng trọng lượng của tôm.................................................... 26 Hình 4.12 Tốc độ tăng chiều dài của tôm ........................................................ 26 Hình 4.13 Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng trong thí nghiệm ....................... 27 v DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT NT1: Đối chứng (không có bổ sung vi khuẩn) NT2: B2 (bổ sung Bacillus chủng B2) NT3: B41 (bổ sung Bacillus chủng B41) TCBS: Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar NA: Nutrient Agar vi CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong gần hai thập kỉ qua nuôi trồng thủy sản đã phát triển mạnh mẽ theo hướng thâm canh hóa. Năng suất và sản lượng thủy sản không ngừng gia tăng, đến trên 52 triệu tấn (2008), tăng trên 4 lần so với thập kỉ 80 (FAO, 2010). Hậu quả của thâm canh hóa làm dịch bệnh lan rộng và gây tổn thất lớn đến nghề nuôi tôm. Sự lạm dụng kháng sinh dẫn đến sự hình thành các vi khuẩn kháng thuốc và tăng mức độ ô nhiễm môi trường. Ngoài ra, dư lượng kháng sinh tích tụ trong các sản phẩm cũng ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng. Trong những năm gần đây, chế phẩm vi sinh đang được sử dụng rộng khắp trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên hiệu quả vẫn chưa được đánh giá đầy đủ nhất là hiệu quả kinh tế (Vũ Ngọc Út, 2011). Ngoài ra các chế phẩm vi sinh có mặt trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc nội địa với chất lượng không ổn định và giá thành cao làm ảnh hưởng đến lợi nhuận của người nuôi. Vì vậy, cần nghiên cứu và lựa chọn các dòng vi khuẩn hữu ích là rất cần thiết trong nuôi trồng thủy sản, hạn chế sự ô nhiễm của môi trường, thúc đẩy và tăng cường sự bền vững của nghề nuôi. Trong những năm gần đây, việc ứng dụng vi sinh trong nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh đang phát triển mạnh và rất cần thiết trong nghề nuôi tôm thương phẩm hiện nay. Với mục đích tạo môi trường tốt cho tôm sinh trưởng và phát triển, giảm bệnh tật, hạn chế sử dụng một số hóa chất và thuốc kháng sinh trong nuôi tôm. Ngoài ra, còn làm giảm các độc tố trong ao xuống mức thấp nhất (chủ yếu NH3 và H2S), cải thiện màu nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong ao, phân hủy tối đa các chất hữu cơ trong ao và làm giảm độ nhớt của nước, phòng tảo nở hoa và hấp thu nguồn tảo chết trong ao … Với tầm quan trọng ngày càng được nâng cao thì việc đảm bảo chất lượng con giống và tăng sản lượng nuôi là vấn đề cấp thiết. Đặc biệt, vấn đề về môi trường nuôi tôm đang gặp nhiều khó khăn do môi trường ngày càng bị ô nhiễm. Vi sinh vật hữu ích đóng vai trò quan trọng trong xu thế hiện nay, chúng cải thiện môi trường nước, phân hủy chất hữu cơ, chuyển hóa các khí độc như NH3, NO2… sang các dạng không độc khác (Vũ Thế Trụ, 2011). Ngoài ra khi bổ sung vi sinh vật hữu ích, nhất là giống Bacillus vào ao nuôi các chỉ tiêu thủy lí, hóa, sinh được cải thiện rõ rệt. Vi khuẩn Bacillus sp là một trong các nhóm vi khuẩn nhiều nhất trong chế phẩm vi sinh, nó có vai trò quan 1 trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và enzyme (Ferarri et al., 1993). Để đánh giá hiệu quả xử lí môi trường cũng như tác động lên chất lượng tôm thẻ nuôi của các dòng vi khuẩn Bacillus được phân lập trong ao nuôi tôm sú thâm canh, một nghiên cứu được thực hiện trong bể nuôi tại khoa Thủy Sản nhằm “Xác định sự ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus sp lên tôm thẻ chân trắng”. 1.2Mục tiêu của đề tài: Đánh giá khả năng cải thiện môi trường và kháng Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. trong bể nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). 1.3 Nội dung của đề tài: Xác định ảnh hưởng của ba dòng vi khuẩn Bacillus sp lên khả năng cải thiện môi trường dựa trên các chỉ tiêu chất lượng nước và so sánh với bể không bổ sung Bacillus sp. Xác định sự biến động của tổng vi khuẩn, tổng Vibrio và vi khuẩn Bacillus sp. trong bể nuôi tôm thẻ trên môi trường Nutrient Agar (NA) và Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS). Xác định tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng khi được bổ sung vi khuẩn vào môi trường sống. 1.4 Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 09/2013 đến tháng 12/2013 tại Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu các dòng vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản Khuất Hữu Thanh (2009), Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm Bio-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm canh từ năm 2008 đến 2010. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv. (2010), nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vi sinh vật hữu ích nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú. Các sản phẩm này đã được thử nghiệm các trại giống tôm sú ở Ninh Thuận. Tại Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ, các tác giả Phạm Thị Tuyết Ngân và Nguyễn Hữu Hiệp (2010) đã phân lập và chọn lọc được 9 chủng vi khuẩn Bacillus từ ao nuôi tôm sú thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng. Trong đó một số chủng đã được thử nghiệm và đánh giá hiệu quả xử lí nước đạt kết quả cao trong phòng thí nghiệm (Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú , 2010). Nghiên cứu của Graslund et al. (2003) cho thấy 86% người nuôi tôm Thái Lan sử dụng vi sinh vật hữu ích để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao nuôi. Moriarty et al. (2005) đã tổng kết vài kết quả nghiên cứu ứng dụng Bacillus trong nuôi tôm đã đạt hiệu quả tốt. Ví dụ: ở Indonesia và Philipphines, năng suất ao nuôi tôm luôn cao và ổn định cho tất cả các ao sử dụng Bacillus đúng kĩ thuật trong khi đó các ao không sử dụng Bacillus gặp thất bại do tôm bệnh (Moriarty, 1998 và 1999). Trong năm 2004, trong 3 ao nuôi tôm ở Teknomin, Andra Pradesh, Ấn Độ, có sử dụng chế phẩm vi sinh trộn vào thức ăn sau 115 ngày nuôi tôm sú đạt 34g với tỉ lệ 25% , trong đó ở ao đối chứng chỉ đạt 25g. Balcazar et al. (2007) tìm thấy Bacillus subtilis UTM 126, là dòng vi khuẩn hữu ích có ảnh hưởng tốt trên tôm nuôi do khống chế được V. parahaemolyticus. Trong các trại giống và ao nuôi tôm thịt, Ziaei-Nejed et al.,(2006) cũng kết luận rằng hệ số chuyển hóa thức ăn, tốc độ tăng trưởng tuyệt đối và năng suất nuôi trong ao có sử dụng hỗn hợp chế phẩm vi sinh gồm 5 loài Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. polymyxa, B. laterosporus và B. corculans) cao hơn đối chứng. Gulliana et al.,(2004) cũng cho biết Bacillus P64, phân lập từ gan tụy của tôm tự nhiên thu từ ao ở Manglarato, Ecuador, có tác dụng ngăn ngừa được bệnh ở tôm. 3 2.2 Khái quát về vi khuẩn Bacillus và tôm thẻ chân trắng 2.2.1 Vi khuẩn Bacillus 2.2.1.1 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản Giống Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào. Bacillus được tìm thấy gần 500 loài, là vi khuẩn hình que, gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, tất cả đều hình thành nội bào tử. Do sự đa dạng sinh thái và loài nên các hoạt chất của chúng cũng rất phong phú. Triển vọng ứng dụng Bacillus trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (Vibrio) giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này.(Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010) 2.2.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản Cải thiện sức khỏe Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa Cung cấp dinh dưỡng trực tiếp: một số nghiên cứu trên các đối tượng nuôi thủy sản như: luân trùng, Artemia, nhuyễn thể, ấu trùng giáp xác, cá… cho thấy Bacillus đã trực tiếp cung cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi đặc biệt là acid béo và vitamin. Một nghiên cứu khác trên cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelinus alpinus L) kết quả cũng cho thấy vi khuẩn có thể đã có vai trò quan trọng trong quá trình dinh dưỡng của cá. Nghiên cứu tương tự trên tôm thẻ trưởng thành (Penaeus chinensis) cho thấy hệ vi sinh vật đã cung cấp nguồn dinh dưỡng và là nguồn thức ăn trực tiếp cho tôm. Vì vậy, ứng dụng vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng thủy sản thường cho kết quả cao về tỉ lệ sống, tăng trưởng và hiệu quả kinh tế. Hỗ trợ tiêu hóa: vài loài vi khuẩn đã được nghiên cứu trên động vật hai mảnh vỏ cho thấy vi khuẩn còn góp phần hỗ trợ tiêu hóa do chúng sản sinh các enzyme như proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn. (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010) Tăng cường các phản ứng miễn dịch Vi khuẩn có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Một nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng hoạt động thực bào của bạch cầu. Nghiên cứu khác của Rengpipat et al. (2000) 4 trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã tiết ra các chất làm tăng đáp ứng cả miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcaszar (2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V. harveyi và virus đốm trắng. Nghiên cứu của Hadi Zokaei et al. (2009) trộn B. subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B. subtilis cũng tăng nhanh trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm. (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010) Cải thiện môi trường Phân hủy các chất thải: Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như carbonhydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm. Bacillus có tác dụng làm giảm COD, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi. Do nhóm vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn vi khuẩn gram (+) thường phân hủy vật chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn nhóm gram (-). Urê và axit uric có trong thành phần chất thải của động vật nuôi thủy sản. Quá trình amôn hóa urê trải qua 2 giai đoạn, urê sẽ bị thủy phân tạo thành muối carbonate amôn. Ở giai đoạn 2, carbonate amôn chuyển hóa thành NH3, CO và H2O. Axit uric bị các vi sinh vật phân giải thành urê và acid tactronic. Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH3. Bacillus tham gia trong quá trình amôn hóa protein là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ, giải phóng NH3. Ban đầu protein bị phân cắt thành pepton, polypeptid oligopeptid, dipeptid và acid amin. Một phần axit amin sẽ được tế bào Bacillus hấp thu làm chất dinh dưỡng, phần khác sẽ thông qua quá trình khử amin tạo thành NH3 và nhiều sản phẩm trung gian khác tùy theo điều kiện. Sản phẩm cuối cùng chủ yếu của quá trình vô cơ hóa hiếu khí protein là ammonia, carbonic, các muối của acid sulfuric và acid phosphoric. Giảm chất độc NH3, H2S: Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bên cạnh NH3 và CO2 còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như acid hữu cơ, rượu, H2S và những dẫn suất của nó như mecaptan, các chất độc như diamin và tomain, indon và scaton. Đây là lý do người nuôi luôn phải duy trì hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao luôn cao để đảm bảo quá trình phân hủy hữu cơ xảy ra hoàn toàn. Ứng dụng Bacillus trong trường hợp này làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ tránh đáy ao, làm giảm các chất dư 5 thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy ao. (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010). Ức chế tác nhân gây bệnh Tiết ra kháng sinh Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn có thể tiết vào môi trường chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh khác. Mục đích gián tiếp là cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường. Nghiên cứu của Stein et al. (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của B. subtilis đã được ghi nhận hơn 50 năm qua. Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn B. subtilis có khả năng tiết ra hơn 20 chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau. Bao gồm: subtilin, ericin, mersacidin, sublancin... Hầu hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn cơ hội gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Các chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn lẻ hoặc kết hợp nhau. Cạnh tranh dinh dưỡng Sự cạnh tranh chủ yếu xảy ra ở nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cạnh tranh cơ chất hữu cơ, là nguồn carbon và năng lượng. Những nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này chưa nhiều. Rico-Mora et al. (1998), đã đưa một dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ. Cấy vi khuẩn này vào bể nuôi tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus, kết quả Vibrio không phát triển. Điều này chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ. Verschuere et al. (1999) đã chọn lọc vài dòng vi khuẩn có ảnh hưởng tốt đến tỉ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia để làm thí nghiệm. Những vi khuẩn này được đưa vào môi trường nuôi Artemia sau khi nước nuôi đã được lọc sạch. Kết quả cho thấy chất kìm hãm được tiết ra môi trường có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh V. proteolytics CW8T2. Vì vậy, những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng lượng và chất dinh dưỡng. Cạnh tranh chất sắt Tất cả các vi sinh vật đều cần chất sắt cho sinh trưởng (Reid et al., 1993). Hiện tượng siderophores là hiện tượng vi khuẩn tiết ra chất kết tủa các ion sắt có trọng lượng phân tử thấp trong môi trường. Các vi sinh vật này sẽ hấp thu các phân tử Fe kết tủa này và làm mất Fe trong môi trường. Các vi sinh vật gây bệnh cần nhiều sắt để tăng trưởng, do vậy dẫn đến hiện tượng cạnh tranh Fe 6 của vi sinh vật trong thủy vực, kết quả làm hạn chế mầm bệnh trong môi trường (Neilands et al., 1981; Wooldridge et al., 1993). Tóm lại, các chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus có thể góp phần làm giảm rủi ro do dịch bệnh nhờ vào khả năng giúp cải thiện sức khỏe của tôm cá, cải thiện môi trường và ức chế tác nhân gây bệnh trong ao nuôi. 2.2.2 Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Litopenaeus vannamei (Bone 1931) Tôm Litopenaeus vannamei (Bone 1931) vỏ mỏng có màu trắng đục nên có tên là tôm Bạc, bình thường có màu xanh lam, chân bò có màu trắng ngà nên gọi tôm chân trắng. Ở vùng biển tự nhiên, tôm chân trắng thích nghi sống nơi đáy là bùn, độ sâu khoảng 72 m, có thể sống ở độ mặn trong phạm vi 5-50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28-34‰, pH = 7,7-8,3, nhiệt độ thích hợp 25-32oC, tuy nhiên chúng có thể sống được ở nhiệt độ 12–28oC. Tôm thẻ chân trắng là loài ăn tạp giống như những loài tôm khác. Song không đòi hỏi thức ăn có hàm lượng đạm cao như tôm sú. 2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản 2.3.1 Sơ lược về probiotic “Probiotic là hổn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống” (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Probiotic bao gồm những vi khuẩn có lợi (vi sinh vật hữu ích) và trong thủy sản hầu hết những sinh vật này là vi khuẩn lactic acid (Lactobacillus Carnobacterium…), giống Vibrio (Vibrio alginolyticus), giống Bacillus (B. 7 subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. polymyxa,…), Actinomycetes, Nitrobacteria…được áp dụng trong các bể ương nuôi, trong ao để hạn chế sự nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh (Xiang-Hong et al., 1998; Lê Đình Duẩn và ctv, 2007). Cũng theo nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv. (2007) một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase, một số vitamin thiết yếu và chất khoáng. Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học giúp xử lý nước và nền đáy ao thường bổ sung thêm các chủng nấm sợi và xạ khuẩn (thuộc nhóm Aspergillus, Streptomyses...). Theo Nair et al. (1985) vi khuẩn lactic acid và một số nhóm vi khuẩn khác có khả năng tiết ra chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus. Sử dụng các nhóm vi khuẩn có lợi phân lập từ ruột cá bơn (Scophthalmus maximus) trong ao nuôi có thể kìm hãm vi khuẩn V.anguillarum gây bệnh (Olsson et al., 1992), điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn có lợi đã cạnh tranh có hiệu quả với nhóm vi khuẩn gây bệnh (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Nghiên cứu của Xiang-Hong et al. (1998) cũng cho biết một số vi khuẩn hữu ích có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo. Tác giả còn cho biết thêm những vi khuẩn có lợi trong nước sẽ loại trừ nhanh NH3, H2S, vật chất hữu cơ có hại. Ngoài ra, chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi. Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh vật hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Verschuere et al. (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến chất lượng nước, do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Vì vậy, Bacillus sp. giúp giảm tích lủy chất hữu cơ và các chất hòa tan (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). 3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al., 1998). Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còn tăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng. 8 Theo Vijayabaskar et al. (2008) ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà cụ thể là nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn A.hydrophila gây ra. Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippine, khi việc sử dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc, mà xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh đến con người nếu sử dụng quá liều lượng. Vì lý do đó mà probiotic được ứng dụng rộng rãi cho nghề nuôi tôm ở Philippine, nghiên cứu cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm bệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học (Moriarty et al., 1999). Nhiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sịnh học trong nuôi thủy sản cho kết quả rất khả quan, không chỉ cải thiện chất lượng nước, giảm lượng dùng kháng sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có thể nâng cao năng suất nuôi và chất lượng của sản phẩm (Xiang-Hong et al., 1998). Probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi thủy sản. Nhưng việc sử dụng Probiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản chất của các vi sinh vật có ích và đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi (Balcaszar et al., 2006). 2.4 Sự siến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi thuỷ sản. 2.4.1 Nhiệt độ Trong các ao nuôi nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp các chất hữu cơ cho cơ thể sinh vật, cũng như vai trò phân huỷ của vi sinh vật và trao đổi chất của tôm nuôi. Theo Whetstone et al. (2002) tôm có thể sống tốt ở nhiệt độ 23-34oC tối ưu là 26 - 29 oC nhưng không thay đổi quá 5 oC trong ngày (Boyd et al., 2003). 2.4.2 pH Theo Chanratchakool et al. (1995) thì pH của nước rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi. pH thích hợp cho tôm nuôi 7.50 - 8.35 và khoảng dao động hằng ngày không vượt quá 0.5 đơn vị pH. Nguồn nước có độ pH từ 7,5-8,5 là điều kiện tối ưu để vi khuẩn nitrate hóa tăng trưởng. Khi giá trị pH > 8,5 vi khuẩn Nitrobacter có thể bị ức chế nhiều hơn Nitrosomonas làm cho nitrite được tích lũy (Briggs et al., 1994). Nitrite được chuyển hóa thành Nitrate nhờ vi khuẩn Nitrobacter (Soon et al., 1999). Từ những kết quả trên có thể nhận định pH thích hợp nuôi trồng thủy sản nói chung là từ 6-9 và riêng nuôi tôm thẻ từ 7,5-8,5 là phù hợp nhất (pH tốt nhất nên gần bằng 8,0). 2.4.3 TSS 9 TSS biểu thị vật chất lơ lửng trong nước làm hạn chế quá trình quang hợp của thực vật thủy sinh do cản trở khả năng xuyên ánh sáng vào nước, làm giảm hàm lượng oxy hòa tan trong nước. Trong ao nuôi tôm nếu độ đục được thể hiện bởi sinh lượng của phiêu sinh vật thì đây là một yếu tố có lợi, trong khi đó độ đục được biểu thị bởi vật chất lơ lửng, hạt sét thì sẽ gây bất lợi cho tôm nuôi (Hargreaves et al., 1999). Theo Boyd et al. (2002) thì độ đục tốt cho ao nuôi dao động từ 40-100 ppm nhưng không dao động quá 10%. Trong thực tế ao nuôi thì độ đục thường tăng dần về cuối vụ, chúng chịu tác động của các yếu tố nội tại như sục khí (quạt nước) hay do bên ngoài tác động (sóng gió) làm xói lở thành ao hay nguồn nước cấp và thức ăn dư thừa theo thời gian (Hargreaves et al., 1999). 2.4.4 Oxy hòa tan (DO – Dissolved Oxygen) Oxy hòa tan trong nước lý tưởng cho tôm là trên 5 ppm (Swingle, 1969 được trích bởi Lê Bảo Ngọc, 2005) và không được vượt 15 ppm (Whetstone et al., 2002). Theo nghiên cứu của Summerfelt (1996) thì hàm lượng oxy hòa tan vào trong nước chịu sự chi phối bởi nhiệt độ, nhiệt độ càng tăng thì hàm lượng oxy bão hòa trong nước càng giảm. Nếu nhiệt độ nước ở 10°C thì hàm lượng oxy bão hòa là 11,3 ppm, khi nhiệt độ tăng lên ở 25°C thì hàm lượng oxy bào hòa giảm xuống 8,5 ppm. Nghiên cứu tốc độ tiêu thụ oxy hòa tan cho thấy sự hô hấp của quần thể sinh vật đáy có thể dễ dàng tiêu thụ từ 2-3 ppm oxy hòa tan trong nước ao trong vòng 24 giờ (Boyd, 1998). Wang et al. (2000) nghiên cứu sự phân phối oxy trong ao cho thấy có 70% lượng oxy tiêu hao cho các sinh vật đáy, sự oxy hóa các hợp chất hữu cơ và chỉ có 20% lượng oxy tiêu tốn cho quá trình hô hấp của tôm. 2.4.5 Tiêu hao oxy hóa học (COD – Chemical Oxygen Demand) Theo TCVN 5943 (1995), nước sử dụng cho nuôi trồng thủy sản phải nhỏ hơn 35 ppm, trên 35 ppm được xem là ô nhiễm và dưới 10 ppm là nghèo dinh dưỡng. Kết quả thí nghiệm của Briggs và Fung-Smith (1994) khi nuôi tôm ở mật độ 20 con/m2, 30 con/m2, 75 con/m2 thì hàm lượng COD lần lượt là 18,7 ppm, 27,6 ppm và 39 ppm. Ngoài ra còn cho thấy càng về cuối vụ thì hàm lượng COD trong nước ao nuôi càng tăng. 2.4.6 Ammonia tổng cộng (TAN - Total Ammonia Nitrogen) Nồng độ NH3 được coi là an toàn cho ao nuôi là 0,13 ppm (Chen et al., 1998). Trong ao nuôi tôm thì hàm lượng NH3 phải nhỏ hơn 0,1 ppm được xem là thích hợp (Whetstone et al., 2002). Các hợp chất vô cơ hòa tan quan trọng của nitơ là NH3, NH4+, NO3− và NO2−. Trong đó NH3 và NO2− độc đối với các loài 10 động vật thủy sinh còn NH4+ và NO3− là nguồn dinh dưỡng tốt mà thực vật thủy sinh dễ hấp thu nhất tạo nên các hợp chất hữu cơ trong thủy vực. Ngoài ra, NH3 và muối của nó sẽ biến thành dạng đạm Nitrite (NO2−) và Nitrate (NO3−) nhờ vi khuẩn Nitrite và Nitrate hóa. Tuy nhiên NH3 được cung cấp trong các thủy vực từ quá trình phân hủy bình thường các protein, xác bã động thực vật, sản phẩm bài tiết của động vật hay từ phân bón vô cơ và hữu cơ, trong đó nguồn NH3 chủ yếu từ sự bài tiết trực tiếp của động vật thủy sinh (Chen et al., 1992; 1998). Theo Adhikari et al., (2003) cho rằng NH3 trong khoảng 0,02-0,05 ppm là tối ưu cho ao nuôi thủy sản, trong môi trường nước mặn NH3 và NO2− ít gây độc cho tôm, việc xử lý Formalin có thể làm giảm độ độc của NH3 và việc bón phân là phương pháp tốt nhất làm giảm độc tính của Nitrite trong ao nuôi (Adhikari et al., 2003; Limsuwan et al., 1997). 2.4.7 Độ kiềm tổng cộng Tổng hàm lượng base trong nước tính bằng mg/L của CaCO3 là tổng độ kiềm. Base trong nước bao gồm: hydroxid, ammonia, borate, phosphate, silicate, bicarbonate và carbonate, nhưng hầu hết nước trong ao, bicarbonate và carbonate cao hơn các base khác . Tổng độ kiềm trong nước có nguồn gốc từ sự hòa tan của đá vôi trong đất, vì vậy hàm lượng tổng độ kiềm được xác định đầu tiên qua tính chất của đất. Ao ở vùng đất cát thường có tổng độ kiềm nhỏ hơn 20 mg/L, trong khi ao ở vùng đất đá vôi có tổng độ kiềm lớn hơn 100 mg/L. Mức độ dinh dưỡng của nước ao tăng với sự gia tăng tổng độ kiềm ít nhất 150 mg/L. Tuy nhiên ao nuôi có tổng độ kiềm trên 20 mg/L có thể năng suất cá và động vật thủy sinh khác cao. Nếu độ kiềm dưới 20 mg/L cần phải bón vôi. Ở ao nuôi tôm thì tổng độ kiềm thích hợp trong khoảng 80-120 mg/L. 11 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Thiết bị và dụng cụ Chuẩn bị 9 bể composite có thể tích 100L Máy đo pH và nhiệt độ Máy sục khí Hóa chất cố định mẫu Hóa chất phân tích mẫu Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Và một số dụng cụ khác. 3.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi NaCl, K2HP4, clorine, muối trung hòa Na2S2O3... Môi trường chuyên biệt cho Bacillus, môi trường NA, glucose… Và một số hóa chất khác dùng trong phòng phân tích chất lượng nước tại Khoa Thủy Sản – Trường Đại học Cần Thơ 3.1.3 Nguồn vi khuẩn, tôm thẻ chân trắng, bể nuôi và nguồn nước. Nguồn vi khuẩn: Hai chủng Bacillus B2 và Bacillus B41 đã được phân lập tại khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ. Hai chủng vi khuẩn phân lập được bố trí vào bể tôm thẻ chân trắng. Tôm thẻ chân trắng: tôm được mua từ trại giống tại Cần Thơ, mua về nuôi trong bể cho đến khi tôm đạt trung bình 1 g/con thì bố trí thí nghiệm. Tôm được đo chiều dài và cân 20 con trước khi bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên. Tôm được xử lí bằng formol ở nồng độ 30mg/L khoảng 15-30 phút trước khi bố trí thí nghiệm. Mật độ thả 0,5 con/lít. Nguồn nước biển 100‰ có nguồn gốc từ Vĩnh Châu, Sóc Trăng được pha với nước máy đạt độ mặn 16‰. Nước được xử lí bằng clorine với nồng độ 30mg/L, sau đó tiệt trùng bằng Na2S2O3 và sục khí trong khoảng 12-24 giờ. Sau đó kiểm tra lại bằng PDP trước khi cho nước vào bể bố trí. 12