Tài liệu ảnh hƣởng của naa và ba lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây cẩm tú cầu (hydrangea macrophylla (thunb.) ser. ex dc.) in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN ĐỨC THUẬN ẢNH HƢỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) IN VITRO LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Hoa Viên và Cây Cảnh Cần Thơ, 2012 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Hoa viên và Cây cảnh ẢNH HƢỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) IN VITRO Cán bộ hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Ths. Nguyễn Văn Ây Nguyễn Đức Thuận MSSV: 3087751 Lớp: Hoa Viên và Cây Cảnh K34 Cần Thơ, 2012 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài: “ẢNH HƢỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) IN VITRO” do sinh viên NGUYỄN ĐỨC THUẬN thực hiện kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp. Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012 Cán bộ hƣớng dẫn Ths. Nguyễn Văn Ây i TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèm với tên đề tài: “ẢNH HƢỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) IN VITRO” do sinh viên NGUYỄN ĐỨC THUẬN thực hiện và bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp và đã đƣợc thông qua. Luận văn đã đƣợc hội đồng đánh giá ở mức: …………… Ý kiến hội đồng: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……… Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012 Chữ ký của thành viên Hội Đồng Thành viên 1 Thành viên 2 ……………….. …....................... Duyệt của Khoa Trƣởng Khoa Nông Nghiệp & SHƢD ii Thành viên 3 ……….............. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hƣớng dẫn. Các số liệu, kết quả đƣợc trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trƣớc đây. Tác giả luận văn Nguyễn Đức Thuận iii TIỂU SỬ CÁ NHÂN 1. LÝ LỊCH Họ và tên: Nguyễn Đức Thuận Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 09/06/1989 Dân tộc: Kinh Nơi sinh: Huyện Mỹ Xuyên, Tỉnh Sóc Trăng Quê quán: Ấp Hòa Tân, xã Hòa Tú 1, Mỹ Xuyên, Sóc Trăng Con: ông Nguyễn Quốc Nhặt và bà Nguyễn Thị Loan 2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP Năm 1995 - 2000: Học sinh trƣờng tiểu học Hòa Tú 1, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng. Năm 2000 - 2005: Học sinh trƣờng THCS Phƣờng 3, tỉnh Sóc Trăng Năm 2000 - 2007: Học sinh trƣờng THPT Hoàng Diệu, tỉnh Sóc Trăng Năm 2008 - 2012: Sinh viên ngành Hoa Viên & Cây Cảnh K34, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012 Nguyễn Đức Thuận iv LỜI CẢM TẠ Kính dâng Con xin thành kính biết ơn công lao sinh thành và nuôi dƣỡng tựa trời biển của cha mẹ đã giúp con khôn lớn nên ngƣời và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con đƣợc học tập cho đến ngày hôm nay. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp. Thầy Phạm Phƣớc Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cố vấn học tập của lớp, đã tận tâm dìu dắt, rèn luyện và giúp đỡ em trong suốt 4 năm học tại trƣờng Đại Học Cần Thơ. Chân thành cảm ơn: Quý Thầy/Cô và cùng với các anh chị trong phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô, Bộ Môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ. Các bạn lớp Hoa viên & Cây cảnh K34 đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt những chuỗi ngày học Đại Học. Tác giả luận văn Nguyễn Đức Thuận v MỤC LỤC Mục CHƢƠNG 1 1.1 1.2 1.3 Nội dung LỜI CAM ĐOAN TIỂU SỬ CÁ NHÂN LỜI CẢM TẠ MỞ ĐẦU LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật học: Đặc tính thực vật Sơ lƣợc về nuôi cấy mô thực vật Trang III IV V 1 2 2 2 3 1.3.1 1.3.2 1.3.2.1 1.3.2.2 1.3.2.3 1.3.3 1.3.4 1.3.4.1 1.3.4.2 1.3.4.3 1.3.4.4 1.3.4.5 1.3.4.6 1.3.4.7 1.3.4.8 1.3.4.9 1.3.4.10 1.4 Mục đích và ý nghĩa Sự hình thành mô sẹo và tái sinh Định nghĩa mô sẹo Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo sẹo Sự tái sinh mẫu cấy Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tái sinh Môi trƣờng nuôi cấy Nƣớc Các nguyên tố đa lƣợng Các nguyên tố vi lƣợng Nguồn carbohydrate Vitamin Thạch (agar) Nƣớc dừa pH Ánh sáng và nhiệt độ Chất điều hòa sinh trƣởng Một số kết quả nghiên cứu về tạo mô sẹo và tái sinh đã đƣợc thực hiện 3 5 5 6 7 8 9 9 9 9 10 10 11 11 11 12 12 14 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 2.1 2.1.1 Phƣơng tiện Vật liệu 16 16 2.1.2 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Hóa chất 16 16 2.1.4 Địa điểm và thời gian thí nghiệm 17 2.1.5 Điều kiện thí nghiệm 17 vi 2.2 Phƣơng Pháp 17 2.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 17 2.2.2 2.2.3 Bố trí thí nghiệm Xử lý số liệu 17 19 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Ảnh hƣởng của BA và NAA lên sự tạo mô sẹo của lá cây 20 Cẩm tú cầu in vitro. 3.1.1 Tỷ lệ mẫu lá tạo mô sẹo 20 3.1.2 Đƣờng kính mẫu lá gia tăng 24 3.1.3 Chiều cao mẫu lá gia tăng 26 3.2 Khảo sát khả năng phát triển của cụm mô sẹo và tái sinh 28 chồi từ mẫu lá non của cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng MS với các nồng độ BA khác nhau 3.2.1 3.2.2 CHƢƠNG 4 4.1 Tỷ lệ sống của cụm mô sẹo Đƣờng kính cụm mô sẹo gia tăng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 28 30 33 33 4.2 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ CHƢƠNG 1 PHỤ CHƢƠNG 2 33 34 vii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tựa bảng Trang 2.2 Tổ hợp các nghiệm thức của thí nghiệm 1 18 3.1 Tỷ lệ (%) mẫu lá Cẩm tú cầu tạo mô sẹo trên môi trƣờng có nồng độ NAA và BA khác nhau 20 3.2 Tỷ lệ chiều cao lá gia tăng cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng có nồng độ NAA và BA khác nhau 26 3.3 Tỷ lệ chiều cao lá gia tăng cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng có nồng độ NAA và BA khác nhau 27 3.4 Tỷ lệ (%) sống của cụm mô sẹo cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng có nồng độ BA khác nhau 29 3.5 Tỷ lệ đƣờng kính cụm mô sẹo gia tang cây Cẩm tú cầu trên môi 30 trƣờng có nồng độ Ba khác nhau DANH SÁCH HÌNH viii Hình Tựa hình Trang 1.1 Cây và hoa Cẩm tú cầu 2 2.1 Cây Cẩm tú cầu in vitro 16 3.1 Sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Cẩm tú cầu non trên môi trƣờng MS + NAA 3 mg/l + BA 0,1 mg/l nuôi cấy in vitro 20 3.2 Sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Cẩm tú cầu trên môi trƣờng nuôi cấy in vitro 23 3.3 Đƣờng kính mẫu của mô sẹo trên môi trƣờng MS + NAA 4 mg/l + BA 0,1 mg/l 25 3.4 Chiều cao của mẫu lá trên môi trƣờng MS + NAA 4 mg/l + BA 0,1 mg/l 27 3.5 Sự biến đổi cấu trúc của mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung BA 4 mg/l vào thời điểm 6 tuần nuôi cấy 29 3.6 Sự phát triển của mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung BA 5 mg/l vào thời điểm 6 tuần nuôi cấy 31 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BA: Benzyl adenine CĐHST: Chất điều hòa sinh trƣởng ctv: Cộng tác viên LS: Linsmaier and Skoog, 1965 MS: Murashige and Skoog, 1962 NAA: Alpha-naphthalene acetic acid TSKC: Tuần sau khi cấy x NGUYỄN ĐỨC THUẬN. 2012. “Ảnh hƣởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) in vitro”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ ngành Hoa Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hƣớng dẫn: Ths. Nguyễn Văn Ây TÓM LƯỢC Ngày nay, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu chơi hoa kiểng cũng ngày càng tăng. Tuy nhiên số lượng hoa còn hạn chế, hình dáng cây, hoa cũng như màu sắc hoa còn chưa phong phú và đa dạng. Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) là một trong những loại cây có hoa đep, sang trọng và đa dạng về màu sắc. Trong phương pháp vi nhân giống, phương pháp nhân giống thông qua tạo mô sẹo có nhiều ưu điểm hơn nh ư không làm tổn hại nhiều đến cây mẹ, có nguồn mẫu dồi dào, vừa có hệ số nhân chồi cao. Vì vậy đề tài: “Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. exDC.) in vitro” được thực hiện nhằm xác định nồng độ các NAA và BA thích hợp để tạo mô sẹo và khả năng phát triển mô sẹo của lá cây Cẩm tú cầu in vitro. Kết quả thí nghiệm cho thấy: (i) Môi trường MS bổ sung NAA (2-4 mg/l) hoặc MS bổ sung NAA (2-4 mg/l) kết hợp với BA 0,1 mg/l có hiệu quả tối ưu trong việc cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy lá non cây Cẩm tú cầu in vitro (đạt 100% sau 10 tuần nuôi cấy), (ii) Môi trường MS bổ sung BA ở nồng độ từ 1 -5 mg/l đều có hiệu quả cho sự phát triển của mô sẹo cẩm tú cầu sau 6 tuần nuôi cấy. Từ khóa: Cây Cẩm tú cầu, BA, NAA, mô sẹo, tái sinh, in vitro. xi MỞ ĐẦU Ngày nay, cuộc sống của con ngƣời ngày càng đƣợc nâng cao, nhu cầu chơi hoa kiểng cũng ngày càng tăng. Tuy nhiên số lƣợng hoa còn hạn chế, hình dáng cây, hoa cũng nhƣ màu sắc hoa còn chƣa phong phú và đa dạng. Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thumb.) Ser. ex DC.) là một giống cây thuộc họ Hydrangeaceae có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á (Nhật Bản, Trung Quốc,…). Đây là một loại cây có hoa đep, sang trọng và đa dạng về màu sắc. Câ y có dạng thân thảo bụi, sống lâu năm, hoa hình cầu to đẹp. Cẩm tú cầu nƣớc ta là một loại cây đƣợc ƣa chuộng và trồng rộng rãi dùng để trang trí và làm cảnh, việc nhân giống cây Cẩm tú cầu chủ yếu bằng các phƣơng pháp truyền thống. Trong điều kiện in vivo ngƣời ta tiến hành nhân giống vô tính bằng các phƣơng pháp giâm cành, chiết cành…nhƣng phải mất một khoảng thời gian dài để thu đƣợc kết quả (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002), đó là một kỹ thuật chiếm nhiều ƣu thế nhƣng không làm sạch bệnh và hệ số nhân giống thấp (Dƣơng Công Kiên, 2007). Vì thế việc nhân giống cây đã không đáp ứng đủ số lƣợng theo yêu cầu thị trƣờng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật (Vũ Văn Vụ, 2006). Đây là một công cụ nhân giống tích cực so với các phƣơng pháp nhân giống truyền thống tạo đƣợc cây sạch bệnh, hệ số nhân chồi cao và thời gian sản xuất đƣợc rút ngắn (Dƣơng Công Kiên, 2007). Trong phƣơng pháp vi nhân giống, phƣơng pháp nhân giống thông qua tạo mô sẹo có nhiều ƣu điểm hơn nhƣ không làm tổn hại nhiều đến cây mẹ, có nguồn mẫu dồi dào, vừa có hệ số nhân chồi cao. Tuy nhiên, ở nƣớc ta các phƣơng pháp này còn hạn chế và mới đƣợc áp dụng trong thực tế sản xuất trong lĩnh vực vi nhân giống hoa cảnh, cây nông nghiệp…(Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Đề tài “Ảnh hƣởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) in vitro” đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy có nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển mô sẹo từ lá cây cẩm tú cầu in vitro, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong nhân giống in vitro loại cây này. 1 CHƢƠNG 1 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật học Theo Võ Văn Chi (2004), Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thumb.) Ser. ex DC.), thuộc họ Hydrangeaceae, bộ Hydrangeales. Phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản. Ở Việt Nam, cây cẩm tú cầu thƣờng đƣợc trồng trong các vƣờn cảnh. Tuy nhiên củng có thể gặp cây mọc hoang ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc. 1.2 Đặc tính thực vật Cẩm tú cầu là loại thân thảo bụi, sống lâu năm, cao từ 0,5 - 1 m, thân cây chắc, có phủ lông rậm, ngắn, khi lớn gốc thân hóa gỗ dần, lá mọc đối phiến xoan bầu dục rộng, dài 7 - 20 cm, rộng 4 - 10 cm, mép có răng cƣa, gân phụ 5 - 7, chiều cao cây phụ thuộc vào điều kiện trồng và chăm sóc. Hoa mọc thành cụm hình cầu to; hoa phía ngoài lép, với lá đài to nhƣ cánh hoa, màu trắng rồi chuyển sang màu lam hay hồng khi nắng; hoa sinh sản ở phía trong nhỏ, với 4 - 5 lá đài, 4 - 5 cánh hoa, 4 - 5 nhị, bầu noãn dƣới có 3 -5 buồng (Đặng Minh Quân, 2010). Hình 1.1 Cây và hoa cẩm tú cầu (Nguồn: http://www.cayxanhsadec.com.vn/product/wiew/161.Cẩm-Tú-Cầu.html) 2 1.3 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô thực vật Gottlieb Haberlandt (1902), nhà thực vật học ngƣời Đức, đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ sinh vật nào đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền của cơ thể đó, và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Đức Thành, 2000). Sau đó khi Went và Thimann tìm ra đƣợc chất kích thích sinh trƣởng đầu tiên, sau đó xác định là indole acetic acid (IAA). Năm 1939, Gautheret và Nobecourt đã duy trì đƣợc sự sinh trƣởng của mô sẹo Carrot (Daucus carota) trong một thời gian dài (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nƣớc dừa trong nuôi cấy phôi non ở Carrot Patura. Năm 1957, Skoog và Miller tạo ra đƣợc chồi từ mảnh mô thân cây thuốc lá, đồng thời khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin/cytokinin: nồng độ auxin/cytokinin <1 có xu hƣớng tạo ra chồi, ngƣợc lại khi nồng độ auxin/cytokinin >1, mô có xu hƣớng tạo rễ và tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật đã có những bƣớc tiến vƣợt bậc với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọn tạo giống cây trồng nhƣ: đột biến soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bào trần, tạo dòng kháng thể, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn trên nhiều đối tƣợng cây trồng. Ở Việt Nam kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào đã đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu nhân nhanh và phục tráng giống cây trồng (Lê Trần Bình và ctv., 1993) và các ứng dụng này đã giúp ích cho nhiều nƣớc phát triển nông nghiệp, lâm nghiệp và cây cảnh theo hƣớng công nghệ cao (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). 1.3.1 Mục đích và ý nghĩa Nuôi cấy in vitro là một từ rất tổng quát để chỉ việc nuôi cấy tế bào hay mô để chúng phát triển trong môi trƣờng dinh dƣỡng vô trùng trong một thời gian vô hạn, mục đích chính là nhân những dòng thành lƣợng lớn (Lâm Ngọc Phƣơng, 2009). Bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, chúng ta có thể khắc phục đƣợc khó khăn mà phƣơng pháp truyền thống nhƣ giâm cành, chiết cành,… không làm đƣợc và dễ dàng tạo ra đƣợc những phát sinh hình thái đƣợc phân biệt một cách rõ rệt. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo chiều hƣớng mong muốn. 3 Nuôi cấy mô là một phƣơng pháp làm gi ảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2010), tạo đƣợc số lƣợng cây con lớn và đồng đều, đáp ứng nhu cầu thị trƣờng (Dƣơng Công Kiên, 2007). Đó đƣợc xem là một phƣơng pháp rất thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển, việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi (Nguyễn Đức Thành, 2000). Hiện nay, phƣơng pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm đã trở thành một kỹ thuật nông nghiệp phổ biến, đƣợc sử dụng để phục tráng giống và nhân các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao. Theo Lâm Ngọc Phƣơng (2009), việc nhân giống vô tính trong ống nghiệm nhằm các mục đích: Tạo đƣợc một số lƣợng lớn cây con giống cây mẹ Tạo nên một sự chọn lọc các gốc mẹ Cứu lấy các loại thực vật đang trên con đƣờng bị biến mất. Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng kỹ thuật trồng đại trà, có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp nhƣ sau: - Kiểm soát đƣợc dịch bệnh cây trồng. Bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại đƣợc những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh - Kiểm soát đƣợc chất lƣợng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất - Kiểm soát đƣợc toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch - Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối. Sự đồng loạt này giúp cơ giới hóa đƣợc khâu trồng trọt và khâu thu ho ạch. Do đó năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lƣợng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ và chế biến (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Ở Việt Nam nhân giống vô tính in vitro đã thành công trên nhiều loài cây, trong đó có những cây quan trọng về mặt kinh tế nhƣ: lúa, bắp, khoai tây, rau, các loại hoa, cà phê, cau su, một số cây thân gỗ có giá trị,… (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). 4 1.3.2 Sự hình thành mô sẹo và tái sinh 1.3.2.1 Định nghĩa mô sẹo (callus) Mô sẹo bao gồm một khối vô định hình của các tế bào nhu mô có vách mỏng đƣợc sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Mô sẹo là một khối tế bào không tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dƣới các điều kiện đặc biệt nhƣ vết thƣơng, xử lý với chất điều hòa sinh trƣởng thực vật,… (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Trong quá trình tạo mô sẹo từ lá song tử diệp, mô sẹo xuất hiện trƣớc hết là ở vị trí vết cắt, kế đến là xuất hiện ở vùng đáy lá, vùng giữa của lá (Pal và ctv., 1985) hay ở hệ thống mạch (Gleddie và ctv., 1983). Sự hình thành mô sẹo ở vết thƣơng là sự thích ứng bảo vệ và có thể chia làm ba giai đoạn: kích thích, phân chia và chuyên hóa. Mô sẹo khi hình thành gồm hai loại: loại xốp chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng, không bào to và loại cứng gồm các loại tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc, không bào to (Vũ Văn Vụ, 1999). Mô sẹo khi hình thành nếu đƣợc tiếp xúc duy trì trong môi trƣờng có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ nhanh, nhƣng nếu chuyển sang một môi trƣờng có đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng nhƣng không có sự hiện diện của các auxin thì s ự tăng sinh của callus diễn ra rất chậm (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), việc tạo mô sẹo có những ƣu điểm nhƣ: - Đạt đƣợc các cây sạch virus - Tạo các biến dị soma và thể giao tử - Tạo các nguồn vật liệu để cấy tế bào trần và cấy treo - Sản xuất cây con thông qua sự tạo phôi soma và tạo đƣợc cơ quan - Sản xuất các chất biến dƣỡng thứ cấp hữu ích - Chọn lọc tế bào có đặc tính kháng với môi trƣờng bất lợi - Nghiên cứu sự tạo đột biến Các tế bào thuộc mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thƣờng phản phân hóa dƣới tác động của auxin (riêng lẽ hay kết hợp với cytokinin) để cho ra mô sẹo. Mô sẹo đƣợc tạo ra ngoài nguyên do tế bào các tƣợng tầng, sự xáo trộn các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan. 5 1.3.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo mô sẹo Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa, kiểu gene (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trƣờng nuôi cấy (Pal và ctv., 1985). Ánh sáng: trong sự tái sinh chồi in vitro từ lá cây Lê hoang dại, quá trình nuôi cấy mô đƣợc chia làm 2 giai đoạn: giai đoạn 1 (30 ngày) trong tối và giai đoạn 2 ngoài ánh sáng đã làm gia tăng số chồi đƣợc tái sinh. Điều kiện tối cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào lá để tạo mô sẹo và giai đoạn sáng biểu hiện (tái phân hóa) để tái sinh chồi (Caboni và ctv., 1999). Theo Pierik (1987) trong suốt thời gian tạo mô sẹo tùy theo mẫu cấy mà ánh sáng có thể cần hay không cần thiết. Tuy nhiên mô sẹo trong tối tăng trƣởng tốt hơn mô sẹo dƣới điều kiện sáng do tác động ức chế của ánh sáng đối với mô sẹo (Gibson và ctv., 1993). Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật: Mô sẹo thƣờng đƣợc tạo ra trong môi trƣờng có bổ sung auxin, trong môi trƣờng nuôi cấy các khối u ở các mô và cơ quan, kích thích s ự phân chia tế bào tạo mô sẹo, kích thích tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma, từ huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Tuổi và kích thƣớc mô cấy: tiềm năng phát sinh hình thái c ủa mô cấy khác nhau phụ thuộc vào tuổi của lá. Các mảnh mô hay cơ quan thực vật đã trƣởng thành thƣờng khó tạo mô sẹo hơn các mảnh mô hay cơ quan còn non do các tế bào của chúng đi sâu vào sự biệt hóa nên khó trở lại trạng thái tế bào phân sinh. Do vậy, chúng ít có khả năng phân chia khi bị áp dụng các chất kích thích nhƣ auxin, hay auxin kết hợp với một cytokinin (Torres, 1989). Các lá non Echeveria elegans (họ Crassullaceae) tăng trƣởng rễ in vitro sớm hơn tạo chồi, trong khi đó hiện tƣợng ngƣợc lại xảy ra ở các lá già hơn (Narayanaswamy, 1994). Khả năng tái sinh chồi cũng phụ thuộc vào kích thƣớc mô cấy lá. Những mô cấy (thậm chí cả mô sẹo) quá nhỏ không thể đáp ứng với điều kiện nuôi cấy và thƣờng bị hóa nâu. Các mảnh lá Solanum laciniatum có đƣờng kính nhỏ hơn 2 mm không sống đƣợc, trong khi đó những mô cấy có đƣờng kính từ 5 - 10 mm thì có khả năng phát triển nhƣ nhau (Narayanaswamy, 1994). Hƣớng đặt mô cấy: mô cấy lá đặt úp mặt bụng cho tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng có hiệu quả hơn là đặt ngƣợc lại. Mô cấy lá Gasteria và Haworthia tạo ra nhiều phôi soma khi đƣợc đặt nằm úp mặt bụng lá tiếp xúc với bề mặt môi trƣờng hơn là để ngữa mặt lá (Narayanaswamy, 1994). 6 Sự cấy chuyền: một số mô sẹo vẫn duy trì khả năng phát sinh cơ quan một thời gian dài sau vài lần cấy chuyền (Narayanaswamy, 1994; Caboni và ctv., 1999). Số lƣợng cây con sẽ gia tăng sau nhiều lần cấy chuyền cơ quan hay mô sẹo (Bùi Trang Việt, 2000). Nếu nhƣ các môi trƣờng nuôi cấy cứ mãi không tách ra và cấy truyền thì mô sẹo bị hoại tử và chết. Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trƣởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Tuy nhiên, sự cấy chuyền nhiều lần trong thời gian dài cũng làm giảm tiềm năng phát sinh hình thái, đƣợc cho là có liên quan đến tính đa dạng di truyền trong quần thể tế bào. Khả năng cảm ứng chồi bị giảm ở một số loài, nhƣ trong mô sẹo cây thuốc lá, do sự cấy chuyền trên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi (Naraynaswamy, 1994). Khả năng tạo mô sẹo ở mô hay cơ quan phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Ngoài các yếu tố nhƣ kiểu gene, tuổi, còn có một yếu tố khác đó là trạng thái sinh lý của vật liệu nuôi cấy (Nozeran, 1984; Nozeran và ctv., 1982; Torres, 1989). 1.3.2.3 Sự tái sinh mẫu cấy Tái sinh là quá trình mà mô biệt hóa đƣợc khử biệt hóa và chuyển thành mô non trẻ, có khả năng phân chia tế bào và bƣớc vào chu trình tế bào mới, hình thành cơ quan (Klerk và ctv., 1997). Sự tái sinh cơ quan từ mô sẹo tƣơng tự nhƣ sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy. Tế bào của mẫu cấy sẽ phản phân hóa dƣới tác động của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật phân chia hỗn loạn tạo thành mô sẹo. Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), sự tái sinh cơ quan không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp vì: - Những tƣơng quan cần phá vỡ để lặp lại những mối tƣơng quan khác có thể đƣa đến việc tái sinh cơ quan - Sự phân hóa của những tế bào đã phân hóa - Sự phân chia tế bào, đôi khi tạo thành mô sẹo, khi tế bào phân chia thì bắt đầu xảy ra sự hình thành cơ quan. Những mô cảm ứng hình thành những cụm tế bào có tổ chức với tốc độ phân chia tế bào và tạo cơ quan. Mashayeki chỉ ra rằng sự sinh tổng hợp protein trong quá trình tái sinh chủ yếu tập trung ở vùng có khả năng tái sinh cao hoặc sự tái sinh sắp xảy ra. 7