Tài liệu 307530

Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh MỞ ĐẦU Xã hội ngày càng phát triển nên vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm. Do đó các sản phẩm thực phẩm không ngừng được cải tiến nâng cao chất lượng, mẫu mã sản phẩm cũng ngày càng đa dạng. Khi những thành tựu về y học, hóa sinh học, sinh lý học và dinh dưỡng học được soi sáng thì những thực phẩm ăn kiêng, thực phẩm điều trị bệnh, thực phẩm chức năng ra đời. Ngày nay thực phẩm chức năng đang được con người đặc biệt quan tâm vì đây là những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấp, nhưng trong đó lại chứa các hoạt chất có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con người. Trong nhóm thực phẩm chức năng, đường chức năng là một bộ phận quan trọng. Có nhiều loại đường chức năng như: đường Paratinose, maltitol, sorbitol, Fructooligosaccharide (FOS), Trehalose. Trong số đó đường Trehalose là một loại có nhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những người mắc bệnh tiểu đường, béo phì, sâu răng và một số bệnh lý khác. Bên cạnh đó, công nghệ sinh học phân tử cũng đã phát triển nhanh chóng, đạt được những thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn. Sự phát triển không ngừng của sinh học phân tử giúp cho con người hiểu biết cơ sở khoa học một số bệnh nan y, tìm ra các loại thuốc giúp cho con người chống lại các bênh tật và nâng cao sức khỏe đời sống. Thành tựu công nghệ sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp đặc biệt là các sản phẩm chức năng. Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzym ứng dụng trong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng Trehalase là enzym được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhân tố điều chỉnh quá trình đông lạnh, ngăn ngừa quá trình kết tinh, cung cấp giá trị dinh SV: Vũ Thị Hằng 1 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh dưỡng. Do vậy nghiên cứu sản xuất Trehalase là enzym được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhu cầu cần thiết. Đặc biệt trên thị trường Việt Nam hiện nay chủ yếu nhập chế phẩm này từ nước ngoài nên giá thành tương đối cao. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzym Trehalase không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị kinh tế xã hội. Mặt khác, một số chủng vi sinh vật tích lũy các chất hoạt tính sinh học hoặc enzym, kháng sinh cao cũng được ứng dụng ở quy mô lớn mang lại thành tựu và lợi ích kinh tế rất lớn cho con người như chủng Bacillus s.p, Bacillus Licheniformic, Bacillus sterothermophilus, đều có khả năng sinh tổng hợp Trehalase. Nhưng bằng cách nào đó ta có thể thu được Trehalase? Làm cách nào để chủng vi sinh vật Bacillus sterothermophilus có thể sinh tổng hợp Trehalase? Cấu trúc, đặc tính, các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của Trehalase hay các điều kiện tối ưu cho hoạt động của Trehalase như thế nào? SV: Vũ Thị Hằng 2 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới và Việt Nam I.1 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới Enzym có vai trò vô cùng quan trọng, không chỉ xúc tác cho các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (intro). Bởi vậy, công nghệ enzym ngày càng phát triển. Những thành tựu cơ bản về enzym là cơ sở để phát triển các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tiễn. Hàng năm, hàng trăm tấn chế phẩm enzym được sản xuất phục vụ cho ngành công nghiệp và y học. Năm 1980, trên thế giới sản xuất 530 tấn protease từ vi khuẩn, 350 tấn glucoamylase, 320 tấn  – Amylase, 70 tấn glucoisomerase, tất cả trị giá 150 triệu USD. - Amylosidase: sản xuất với sản lượng 5 tấn /năm sử dụng để tách Lacid amin khỏi hỗn hợp DL axit amin (250 tấn L axit amin trên năm) - Amyloglucosidase: sản lượng 1 tấn /năm, sản xuất 3000 tấn glucose từ tinh bột/năm. - Glucoisomerase: sử dụng để sản xuất xiroglucose – fructose 42% (2.150.000 tấn /năm) và xiroglucose- fructose 55% (1.450.000 tấn/ năm). Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng với 4 mục đích chính: -Điều chỉnh những khiếm khuyết của nguyên liệu. Trong công nghiệp chế biến đường, tinh bột, bánh mỳ, bia… người ta bổ xung Amylase để bù hoạt lực enzym yếu của nguyên liệu ngũ cốc. Trong sản xuất fomat, enzym lipase và protease được sử dụng thay thế các enzym từ nguyên liệu sữa bị vô hoạt để thanh trùng. SV: Vũ Thị Hằng 3 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh - Tham gia chuyển hóa, ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất bánh bisque, fomat, nước uống … protease cho phép cải thiện tính lọc của bia và tính năng ổn định của nó ở nhiệt độ thấp. Amylase, pectinase, hemicellulase tạo điều kiện cho việc tách chiết và lọc nước quả. Protease trung tính làm mềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở của bột nhào và độ giòn của bisque. -Tăng giá trị nguyên liệu tự nhiên. Sự phát triển của công nghệ enzym đã cho ra đời một loạt các chế phẩm enzym cho phép tạo ra nhiều sản phẩm: chất làm đặc, chất thơm, chất tạo ngọt, chất tạo chua… việc cải thiện đặc tính của enzym về tính đặc hiệu và tính chịu nhiệt là cơ sở để sản xuất chế phẩm enzym mới thích hợp môi trường và đặc hiệu hơn. - Cải thiện chất lượng sản phẩm: các enzym sử dụng để loại bỏ các chất tự nhiên có ảnh hưởng xấu tới tính chất cảm quan của thực phẩm. Chế phẩm enzym còn cho phép tạo hương vị, màu sắc sản phẩm như lipase trong sản xuất fomat, lactase trong sản xuất sữa. Trong công nghiệp thực phẩm, protease được dùng để làm mềm thịt, công nghiệp bánh mỳ, enzym dịch vị 9 chủ yếu là chimosin thu được từ dạ dày bò được sử dụng để sản xuất fomat, papain từ nhựa đu đủ để làm mềm thịt. Enzym trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu sử dụng để sản xuất đường tinh bột. Đầu tiên người ta sử dụng hai enzym - Amylase và Amylase để sản xuất mật từ tinh bột, sản phẩm này chứa dextrin, glucose và maltose được dùng nhiều trong công nghiệp bánh kẹo. Glucose được sản xuất nhờ - Amylase và - Amylase, tuy nhiên glucose dùng trong thực phẩm có nhược điểm độ ngọt thấp chỉ vào khoảng 0.8 lần đường kính vì vậy nó được dùng chủ yếu cho y dược. Năm 1998, tổng lượng đường tiêu thụ trên thế giới là 10 triệu tấn thì riêng Mỹ tiêu thụ 4.2 tấn Fructose (bao gồm cả xirogluco – fructose), nhật là SV: Vũ Thị Hằng 4 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh 800.000 tấn, EU là 2 triệu tấn, Canada 300000 tấn, Đông Âu 200000 tấn, các nước đang phát triển là 500000 tấn. Sau công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, chế biến thức ăn gia súc. Đặc hiệu việc sử dụng enzym của các hệ vi sinh vật trong nước thải trong công nghiệp xử lý môi trường ngày càng được nghiên cứu khai thác sử dụng. Trong công nghiệp dệt, Enzym từ nước chiết Malt và Pancrease được sử dụng để rũ hồ. Năm 1971, sử dụng enzym Amylase của Bacillus subtilis rũ hồ ở nhiệt độ cao, rút ngắn thời gian. Trong công nghiệp bột giặt và tẩy rửa, các chế phẩm enzym được sử dụng là protease, lipase, cellulose, amylase, oxydoreductase tăng vận tốc và hiệu quả quá trình tẩy rửa. Một số enzym được bổ xung vào các loại xà phòng và kem dưỡng da, thuốc đánh răng như bromelin, collagenase, lipase…các enzym này có tác dụng tẩy hôi, tẩy các vết bẩn bám trên da khá tốt, đồng thời làm mịn và tăng độ đàn hồi cho da. Trong nông nghiệp, enzym dùng để sản xuất thức ăn cho động vật nhằm tăng giá trị thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng cho thức ăn. Các enzym sử dụng với mục đích này là các enzym thủy phân như amylase, protease, đặc hiệu là celluloase và hemicelluloase. Chúng thủy phân các chất có phân tử lớn thành dạng dễ hấp thụ hơn thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn. Sự phát triển của y học phản ánh sự lớn mạnh của tiềm năng enzym. Ngay từ thế kỷ 19 enzym tụy tạng được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Enzym tripsin, chymotripsin sử dụng để làm tiêu viêm, lành vết thương, vết bỏng, viêm phổi, viêm khí quản. Tipsin chữa bệnh viêm tĩnh mạch huyết khối, viêm tụy. Chymotripsin chữa bệnh loét dạ dày tá tràng. Một số enzym tiêu hóa được sử dụng để chữa bệnh suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già và người bệnh như pepsin (từ dạ dày lợn). Ngày nay, một số thuốc tổng hợp hóa học đã lần lượt được thay thế bằng các quá trình enzym nhờ những ưu điểm SV: Vũ Thị Hằng 5 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh của nó. Ví dụ việc sản xuất Pinicillin bán tổng hợp nhờ enzyme penicillin acylase để sản xuất hai dẫn xuất ban đầu 6- APA và 7 – ADCA, từ đó tổng hợp lên kháng sinh thế hệ II, III, IV, V. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật gen và lai tạo tế bào, người ta đã sản xuất được những chất mà cơ thể sống chỉ có thể tổng hợp được với lượng cực nhỏ như interferon, hormone sinh trưởng người, isulin, vaccine… Ngoài việc nghiên cứu enzym trong y học lâm sàng và trong điều trị học, người ta còn nghiên cứu sự phát triển của enzym trong cơ thể từ giai đoạn bào thai cho đến lúc già. Bởi vậy ngày nay enzym học còn đóng vai trò quan trọng trong di truyền học phân tử, trong nghiên cứu quá trình tiến hóa của các giống nòi và trong nhiều lĩnh vực khác. I.2 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam. Việc nghiên cứu và ứng dụng enzym ở Việt Nam chỉ mới được tập trung chú ý trong vài thập kỷ trở lại đây. Cho đến nay Việt Nam chưa có một enzym nào được sản xuất ở quy mô công nghiệp mà mới chỉ dừng lại ở quy mô nhỏ, phạm vi phòng thí nghiệm của các trường đại học, các viện nghiên cứu. Những chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi nhất ở nước ta hiện nay là amylase chủ yếu dùng trong công nghiệp sản xuất rượu bia, đường glucose, đường nha, công nghiệp dệt…Enzyme phân giải protein (protease) tăng độ bền ngọt của bia, công nghiệp chất tẩy rửa, nước chấm, y học… Một số enzyme (chủ yếu nhập từ nước ngoài) được sử dụng rộng rãi trong việc nâng cao chất lượng sản phẩm và đa dạng hóa sản phẩm sữa. Các chế phẩm protease (dùng trong công nghiệp sản xuất nước chấm, chế biến thịt cá) và prozimabo (y học) là các chế phẩm có nguồn gốc từ thực vật. Sản lượng chế phẩm enzyme tiêu thụ hàng năm khoảng 100-300 tấn/năm. Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme trong các ngành công nghiệp ở SV: Vũ Thị Hằng 6 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh nước ta còn ở dạng tiềm năng, do vậy trong những năm tới khả năng ứng dụng của enzyme còn được khai thác và mở rộng ra nhiều lĩnh vực khác: xử lý rác thải sinh hoạt và rác công nghiệp, sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em, sản xuất chế phẩm probiotic, prebiotic… I.3 Enzyme Trehalases I.3.1 Giới thiệu về enzyme Trehalase Trehalase là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nó được dùng khá phổ biến trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Trehalase là một loại enzyme glycoside hydrolase có tác dụng xúc tác cho quá trình chuyển đổi trehalose thành glucose. Nó được tìm thấy trong hầu hết các động vật. Trehalose là đường đôi không khử (α-D-glucopyranosyl1,1-α-D-glucopyranoside) là một trong những nguồn carbohydrate quan trọng nhất xuất hiện trong hầu hết các loại sinh vật, trừ lớp động vật có vú. Disaccharide được thủy phân vào 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase. Có 2 loại Trehalase được tìm thấy trong Saccharomyces cerevisiae (nấm men), là Trehalase trung tính (NT)và Trehalase axit (AT) được phân loại dựa vào độ pH của chúng [4]. NT có độ pH là 7.0 trong khi AT là 4.5. Theo báo cáo mới đây, hơn 90% AT hoạt động trong S. cerevisiae là ngoại bào và tách ngoại bào Trehalose thành glucose trong môi trường chất bao. I.3.2 Trehalase trong vi khuẩn Trehalose được tìm thấy như tích lũy carbonhydrate trong Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium và trong rất nhiều khuẩn tia và là nguyên nhân của khả năng kháng khuẩn. Hầu hết các enzyme Trehalase tách biệt với các vi khuẩn có độ pH từ 6.5 đến 7.5. SV: Vũ Thị Hằng 7 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh Enzyme Trehalase của Mycobacterium là một màng protein bị ràng buộc. Tế bào chất Trehalase của Escherichiacoli K12 được kích thích bở sự tăng cao trong nồng độ thẩm thấu. Sự thủy phân của Trehalose thành glucose diễn ra trong bào chất, và sau đó glucose được chuyển vào các tế bào vi khuẩn. Một tế bào chất Trehalase khác cũng được tìm thấy từ E.coli. Gen mã hóa tế bào chất Trehalase có tính đồng đẳng cao với Trehalase tế bào chất. I.3.3Trehalase trong thực vật Trong thế giới thực vật, mặc dù Trehalose được tìm thấy từ rất nhiều loài cây không hoa bao gồm Selaginella lepidophylla và Botrychium lunaria; đường rất hiếm trong cây có mạch và chỉ được tìm thấy trong quả chín của các loại thuộc Apiaceae và trong lá cây của thực vật hạt kín có khả năng chịu khô hạn như Myrothamnus flabellifolius. Tuy nhiên enzyme Trehalase lại phổ biến trong các loại cây. Điều này rất khó hiểu vì tuy thiếu cơ chất nhưng Trehalase lại có mặt ở các loại thực vật bậc cao. Không có sự chứng minh rõ ràng nào về vai trò hoạt động của Trehalase trong thực vật. Tuy nhiên có nhiều ý kiến cho rằng Trehalases có thể đóng vai trò trong cơ cấu kháng khuẩn hoặc enzyme có thể đóng vai trò trong việc giảm lượng Trehalose có nguồn gốc từ vi sinh thực vật I.3.4 Trehalase trong nấm men Trong S.cerevisiae có ít nhất 2 enzyme Trehalase khác biệt được tìm thấy. Một loại được điều hòa bởi cAMP-phụ thuộc phosphorylation. Hoạt động của loại enzyme này được tìm thấy trong dịch bào tương. Loại enzyme hoạt động thứ hai được tìm thấy trong các không bào của 12 vi sinh vật tương ứng. Nồng độ pH của Trehalase dịch bào tương vào khoảng 7.0 do đó nó được cho vào cùng loại với Trehalase trung tính. Trong khi đó, enzyme Trehalase không bào được cho rằng có khả năng hoạt động tốt nhất tại độ pH SV: Vũ Thị Hằng 8 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh khoảng 4.5 và được coi là Trehalase axit. Hai loại enzyme này mã hóa bởi hai loại gen khác nhau là NTH1 và ATH1 I.3.5 Thủy phân Trehalose Một phân tử Trehalose được thủy phân thành 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase. Thủy phân enzyme của Trehalose lần đầu tiên được tiến hành vào năm 1893 tại Aspergillus niger bởi Bourquelot. Fischer đã thấy được phản ứng này trong S. cerevisiae vào năm 1895. Kể từ lần thủy phân enzyme Trehalose đó, Trehalase (α, α-trehalose-1-C-glucohydrolase, EC 3.2.1.28) đã được tìm thấy trong rất nhiều sinh vật bao gồm động vật và thực vật. Thủy phân Trehalose bằng enzyme Trehalase là một quá trình sinh lý học quan trọng của nhiều loại sinh vật như nảy mầm bào tử nấm, côn trùng bay và tăng trưởng lại trong tế bào không hoạt động tích cực. I.4 Tổng quan về đường chức năng Trehalose I.4.1 Trehalose Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như đường sucrose nhưng ổn định hơn và có vị ngọt nhẹ hơn. Trehalose là đường đa chức năng, vị ngọt nhẹ của nó (45% sucrose). SV: Vũ Thị Hằng 9 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh Hình 1: Biểu đồ hàm lượng đường trehalose, maltose, glucose, sucrose Thành phầần các chầất dinh dưỡng trong đ ường Trehalose: Thành phần Giá trị thành phần trong 100g Năng lượng 628kj/150kcal Protein 0g Carbonhydrate trong đường 100g Hàm lượng chất béo 0g Hàm lượng xenluloza 0g Hàm lượng natri 0g Bảng 1: Thành phần các chất trong đường Trehalose Cấu tạo Trehalose: SV: Vũ Thị Hằng 10 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh Hình 2: Công thức cấu tạo của trehalose SV: Vũ Thị Hằng 11 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh Hình 3:Sơ đồ phản ứng enzyme I.4.2 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể sống I.4.2.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nên khi ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị biến động. Trong gan, hoạt lực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhưng sẽ được bình thường hóa bởi sự cung ứng Trehalose. Như vậy, Trehalose có vai trò khá tích cực trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế Trehalose hiện nay được SV: Vũ Thị Hằng 12 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh dùng nhiều như một chất thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bị bệnh tiểu đường. Từ kết quả của một nghiên cứu khác cho thấy, đối với những người mắc bệnh tiểu đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đường trong máu sẽ giảm nhanh trong 14 ngày. I.4.2.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng Trehalose có thể tăng cường sự hấp thụ canxi của tế bào. Nhờ đặc tính này, Trehalose có thể giúp cho con người phòng chống các bệnh về chuyển hóa và bệnh loãng xương. Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già. Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều có một kết luận chung là do ba yếu tố sau: + Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lên men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi + Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tán vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi. + Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu. Ngoài canxi, Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie. Điều này thúc đẩy quá trình phát triển xương, tăng cường hàm lượng canxi trong xương. I.4.2.3 Ảnh hưởng của trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liên cầu khuẩn gây nên. Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng của người và động vật. Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinh dưỡng thích hợp dễ lên men, phát triển và gây bệnh. Vì thế nếu trong thành SV: Vũ Thị Hằng 13 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh phần thức ăn của ta không chứa hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh. Để xét ảnh hưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người ta đã tiến hành thí nghiệm trên cơ thể chuột. Kết quả cho thấy nhóm chuột thí nghiệm (ăn đường Trehalose) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn Saccaroza) Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi trường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của nó. Đó là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật trên phát triển. Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng. Vì thế ngày nay trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trong thành phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng. I.4.2.4 Tính kháng khuẩn của trehalose SV: Vũ Thị Hằng 14 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh Như chúng ta đã biết probiotic là những chế phẩm chứa nhiều vi sinh vật có lợi như lactobacillus và bifidobacteria. Các vi sinh vật này có khả năng kháng khuẩn gây bệnh đi ngoài. Hiện nay các chế phẩm probiotic bán trên thị trường thường chứa nhiều đường Trehalose, bởi đường Trehalose có tác dụng là cơ SV: Vũ Thị Hằng 15 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh Hình 4: Một số loại thực phẩm chứa Trehalose Phụ thuộc vào độ tinh khiết Trehalose thương phẩm chủ yếu có hai loại là Trehalose có độ tinh khiết 45% và Trehalose có độ tinh khiết cao hơn 70%. Với độ tinh khiết 45% thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩm hoặc như một loại chất ngọt bổ xung trong chế biến các loại thực phẩm khác. Còn đường có độ tinh khiết cao hơn 70% thường dùng cho các đối tượng mắc bệnh, các đối tượng ăn kiêng. Ngoài ra đường tinh khiết 100% dùng trong việc phân tích hóa học. Đường Trehalose có nhiều đặc tính sinh học đáng quý, có hương vị và tính chất hóa lý tương tự đường kính nên được sử dụng thay thế đường kính trong sản xuất các loại thực phẩm chứa đường như kẹo, bánh và bột dinh dưỡng trẻ em.v.v… Sản phẩm sau khi cải tiến này sẽ có giá trị cao về mặt dinh dưỡng cũng như chức năng phòng ngừa bệnh tật đồng thời hương vị cũng được cải tiến rất nhiều. Trên thế giới việc sử dụng đường Trehalose trong sản xuất các mặt hàng chức năng như sữa, bánh kẹo, thức ăn cho người bệnh.v.v… Các sản phẩm được bổ sung đầu tiên là bánh quy, sữa chua. Ngày nay đã được dùng cho các sản phẩm đồ uống. Ngoài ra, Trehalose còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Đường có độ tinh khiết thấp có thể làm chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy một số vi khuẩn, loại có hàm lượng trung bình dùng cho người ăn trực tiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phân tích. Trehalose cũng được sử dụng như một loại dược phẩm dùng nhiều cho các đối tượng người già, trẻ em và người bệnh trong thời kỳ phục hồi sức khỏe để tăng cường hoạt động tiêu hóa, giúp cho các đối tượng trên nhuận tràng ăn tốt. Trehalose có tính hòa tan cao SV: Vũ Thị Hằng 16 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh Hình 5: Tính hòa tan của Trehalose và Sucrose SV: Vũ Thị Hằng 17 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Nguyên vật liệu và hóa chất II.1.1 Giống vi sinh vật Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 alpha. E.coli được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria – Bertani) [1% tryptone, 0.5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100µg/ml ampicillin để làm nhân tố chọn lọc. II.1.2 Plasmid: DNA mang gen Trehalase được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh Học Hàn Quốc, Seoul II.1.4 Hóa chất Tinh bột tan (Trung Quốc), bactotryton (Hàn Huốc), bacto yeast extract (Hàn Quốc), NaCl (Trung Quốc), canxiclorua (Trung Quốc), agar (Việt Nam), glycerol (Việt Nam), acrylamide (Trung Quốc), N,N-methylene-bis Acrylamide (Trung Quốc), glycine (Trung Quốc), sodiummetabisulfate (Trung Quốc), methanol (Trung Quốc), acetic acid (Trung Quốc), Amononium persulfate (ASP, USA), Ampicillin (USA), comassie-blue R-250 (USA), axit photphoric (Trung Quốc), ethanol (Trung Quốc), Tris-base (Sigma, USA), phenol (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), potassium Sodium Tartrate (Trung Quốc), EDTA (USA), SDS (USA), DNS 3,5 Dinitro salicylic (Trung Quốc), Imidazole (Hàn Quốc), Glucose (Trung Quốc), Maltose (Trung Quốc), NaH2PO4(Trung Quốc), Na2HPO4(Trung Quốc), 2mercaptoethanol (Đức), Bromophenol blue (Đức), NaHCO3 (Trung Quốc), Na2CO3(Trung Quốc), potassium acetate (Hàn Quốc), Boric axit (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), TEMED (Trung Quốc), APS (Trung Quốc), Dithiotheritol (Hàn Quốc), Ethidumbromide (Hàn Quốc) SV: Vũ Thị Hằng 18 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh II.1.5 Máy móc và thiết bị Máy li tâm (Trung Quốc), máy so màu quang điện, máy đo pH, máy lắc (Trung Quốc), bình ổn nhiệt (Trung Quốc), nồi hấp (Trung Quốc), máy khuấy từ (Trung Quốc), máy siêu âm (Trung Quốc), cân điện tử (Đức), máy điện di (Trung Quốc), tủ sấy, box cấy (Trung Quốc), cân kỹ thuật (Mỹ), buồng điện di DNA (Nhật), máy li tâm lạnh siêu tốc liên tục (Đức). Và các dụng cụ cần thiết khác như bình tam giác, ống nghiệm, ống eppendof, đầu côn xanh, đầu côn vàng, đĩa peptri, pipet thủy tinh và pipet nhựa, blank,….. II.2 Phương pháp nghiên cứu II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha bằng phương pháp sốc nhiệt Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang thể nhận. Có nhiều phương pháp biến nạp được sử dụng như biến nạp bằng xung điện, sốc nhiệt…Trong đó biến nạp bằng sốc nhiệt là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao. Cơ chế biến nạp chủ yếu bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể tiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp nhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả biến Nguyên tắc: Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA. Tạo hỗn hợp vi khuẩn với DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao (4oC). Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và SV: Vũ Thị Hằng 19 Báo cáo khoa học học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh cố định trong tế bào vi khuẩn. Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứa môi trường có bổ sung kháng sinh. Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp. Phương pháp tiến hành như sau: + Tạo tế bào khả biến DH5 alpha Hoạt hóa tế bào E.coli trên môi trường thạch LB (1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl; 2% Agar) ở 37 oC, 24 giờ. Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 5ml LB lỏng Hình 6: Vi khuẩn E.coli trong LB rắn (khuẩn lạc) Môi trường LB lỏng: 1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl Nuôi trên máy lắc (37oC, 12 – 14 giờ). Sau đó lấy 1% dịch nuôi cấy trên (50µl cho 50ml môi trường nuôi cấy LB) tiến hành lắc trên máy lắc 200 – 250 rpm ở 37oC để đạt được Abs 600 (khoảng 2 – 3 giờ). Tiếp đó chuyển dịch SV: Vũ Thị Hằng 20