Tài liệu [123doc] goc tu do nguyen nhan sinh ra goc tu do va cac phuong phap xac dinh hoat tinh chong oxy hoa

MỤC LỤC Lời mở đầu 2 1. Gốc tự do 1.1. Định nghĩa 3 1.2. Nguyên nhân sinh ra gốc tự do 4 1.3. Các loại gốc tự do 5 1.3.1. Các loại gốc tự do (ROS) 5 1.3.2. Các loại gốc tự do (RNS) 7 1.4. 2. 3 Tác hại của gốc tự do Hoạt tính chống oxi hóa 2.1. Hoạt chất chống oxy hóa 8 11 11 2.1.1. Khái niệm 11 2.1.2. Cơ chế của chất chống oxi hóa 11 2.1.3. Phân loại chất chống oxy hóa (antioxidant) 11 2.1.4. Phân loại chất chống oxi hóa trong thực phẩm 13 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 13 2.2. 2.2.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 13 2.2.2. Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự do NO 16 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 18 2.2.4. Phương pháp đo MDA 20 2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng trong các dịch trích từ thực vật 21 2.2.6. Phương pháp ORAC 22 2.2.7. Phương pháp FRAP 25 2.2.8. Phương pháp TRAP 25 Tài liệu tham khảo 26 1 LỜI MỞ ĐẦU Như chúng ta đã biết: Oxy là một phần tử bắt buộc đối với cuộc sống, các hệ thống sống đã tiến hóa để tồn tại trong sự hiện diện của phân tử oxy và đối với hầu hết các hệ thống sinh học. Tính chất oxy hóa của oxy đóng một vai trò quan trọng trong hiện tượng đa dạng sinh học. Oxy có tính hai lưỡi, là phần thiết yếu cho cuộc sống; nó cũng có thể làm trầm trọng thêm những thiệt hại bên trong các tế bào bằng sự kiện oxy hóa. Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy(reactive oxygen species-ROS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy. Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm cho con người. Khoảng vài chục năm về đây, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxi hóa ngày càng được chú trọng nhiều trong ngành Y, Dược và Sinh học. Gốc tự do gia tăng quá mức là nguyên nhân phát sinh bệnh tật. hiện có hơn 60 loại bệnh ở người có liên quan đến gốc tự do. Nhiều loại thuốc là các chất chống oxi hóa có khả năng loại bỏ các gốc tự do đang được dùng để dự phòng và điều trị các bệnh viêm nhiễm, bệnh tim mạch, ung thư, lão hóa… Theo tiến sĩ Bruce Ames của Đại học Berkley, California thì mỗi tế bào đơn lẻ của cơ thể mỗi ngày phải chịu khoảng 10.000 cú tấn công. Rất nhiều cuộc tấn công trong số này nhắm vào các DNA, việc này đưa đến một trong những hậu quả là làm gia tăng tốc độ biến đổi của gen, từ đó dẫn đến sự biến đổi tế bào và gây nguy cơ ung thư. Ngoài ra, màng tế bào, protein và mỡ cũng bị các gốc tự do bắn phá và gây tổn hại. Gốc tự do rất nguy hiểm vì thế để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống ôxi hóa bổ sung như vitamin A, vitamin C, vitamin E, polyphenol,… Chất chống oxi hóa là một loại phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác. Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng. Chất chống oxi hóa làm giảm tác dụng của cách quá trình oxi hóa nguy hiểm bằng cách liên kết với nhau với các phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt của chúng. Nhận thấy sự nguy hiểm của các gốc tự do và để hiểu rõ hơn về nó nhóm em sẽ nghiên cứu đề tài: ‘‘Các gốc tự do, nguyên nhân sinh ra gốc tự do và các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa’’. Với những hiểu biết còn hạn chế nên trong quá trình làm tiểu luận không tránh khỏi những sai sót thế nên nhóm em rất mong nhận được sự thông cảm cũng như những góp ý của Thầy để có thể tốt hơn trong quá trình học tập. 2 1. Gốc tự do .1. Định nghĩa: Gốc tự do là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có các điện tử lẻ đôi ở vòng ngoài nên mang điện tích âm và có khả năng ôxy hóa các tế bào, các phân tử, nguyên tử khác. Các gốc tự do có thể liên quan đến nhiều phản ứng trong các mô sống với vai trò như những chất trung gian có hoạt tính mạnh trong thời gian ngắn, ví dụ như trong hiện tượng quang hợp. Do bị mất điện tử nên gốc tự do rất không ổn định và luôn có xu hướng chiếm đoạt điện tử từ các cấu trúc lân cận, tạo ra hàng loạt gốc tự do mới. Quá trình này diễn ra theo phản ứng dây chuyền, gây tổn thương màng tế bào, các phân tử protein và ngay cả ADN... Hậu quả là xuất hiện những biến đổi làm tổn hại, rối loạn chức năng, thậm chí gây chết tế bào. (1) Mỗi ngày một tế bào phải hứng chịu 10.000 đợt tấn công của các gốc tự do. Và trong suốt 70 năm cuộc đời, chúng ta sẽ phải liên tục chống chọi với 17 tấn gốc tự do 3 .2. Nguyên nhân sinh ra gốc tự do: Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH., O2.-, NO.,…) như tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch…Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống ôxi hóa bổ sung như Vitamin A, vitamin C, vitamin E, polyphenol,… Gốc tự do hình thành từ hai nguồn, đó là nguồn nội sinh và nguồn ngoại sinh.(2,3) + Ở nguồn nội sinh, gốc tự do hình thành: - Từ chuỗi chuyền điện tử trong ty thể (các phản ứng phosphoryl oxy hóa của mitochondria): superoxide anion (O2●), peroxynitrate (ONO-), hydrogen peroxide (H2O2), gốc hydroxyl (●OH). - Từ hoạt động hô hấp của leucocyte, gốc tự do hình thành để giết vi khuẩn. - Từ quá trình tự chết của tế bào (apoptosis): bằng in vitro, người ta thấy chất oxy hóa nội sinh AXO có thể ngăn trở apoptosis. 4 + Ở nguồn ngoại sinh, gốc tự do hình thành từ khí ozone, bức xạ tử ngoại, khói thuốc lá.(3) .3. Các loại gốc tự do ..1. Các loại gốc tự do (ROS) ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của cơ thể và đóng vai trò quan trọng trong liên lạc tế bào và cân bằng nội môi. Tuy nhiên, trong thời gian bị tác động stress từ môi trường (như UV hay tiếp xúc với nhiệt độ cao,…), nồng độ ROS có thể tăng lên 1 cách đột ngột. Nó có thể làm tổn thương các cấu trúc của tế bào. Đó được gọi là stress do oxi hóa (oxidative stress). ROS ngoại sinh cũng có thể được tạo thành do các bức xạ ion hóa.(4) 5 * ROS ngoại sinh. ROS ngoại sinh có thể được tạo ra từ chất ô nhiễm, thuốc lá, khói bụi, các chất độc hóa học hoặc phóng xạ. Các phóng xạ ion hóa có thể phản ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tức cho sinh vật, một quá trình được gọi là sự phân ly do phóng xạ. Vì nước chiếm tới 55-60% cơ thể nên khả năng xảy ra sự phân ly do phóng xạ là rất cao trong trường hợp có sự hiện diện của các phóng xạ ion hóa. Trong quá trình này, nước bị mất một electron và trở nên rất hoạt động. Và sau đó một chuỗi phản ứng 3 bước, nước được chuyển thành gốc hydroxy (OH), hydrogen peroxide (H2O2), gốc superoxide (O2-) và oxygen phân tử (O2). Gốc hydroxy rất hoạt động, có thể di chuyển electron ở bất kì phân tử nào nằm trên đường đi của nó, chuyển phân tử này thành gốc tự do và vì vậy hoạt hóa một chuỗi phản ứng tiếp tục. nhưng hydrogen peroxide thì nguy hiểm với DNA hơn là gốc hydroxy vì khả năng hoạt động thấp hơn của nó cho phép nó có đủ thời gian để cho phân tử di chuyển vào nhân, rồi sau đó tiến hành phá hủy các đại phân tư như DNA.(5) * ROS nội sinh. ROS nội bào được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, các nguồn chính gồm có ti thể, peroxisome, hệ võng nội bào và phức hợp NADPH oxidase (NOX) ở màng tế bào. Ti thể sản xuất năng lượng cho tế bào, adenosine triphotphate (ATP). Quá trình sản xuất ATP gọi là sự phosphorin hóa oxide hóa, gồm có chuỗi vận chuyển proton (ion hydrogen) xuyên màng ti thể, gọi là chuỗi truyền electron. Trong chuỗi vận chuyển electron, electron được truyền qua một chuỗi các protein thông qua các phản ứng oxi hóa – khử mà mỗi chất nhận sau lại có tình khử lớn hơn chất trước. Chất nhận electron cuối cùng là oxygen. Trong điều kiện bình thường, oxigen bị khử để tạo thành nước; tuy nhiên, vẫn có 1 tỉ lệ nhỏ từ 0,1% – 2% electron vượt qua được chuỗi truyền điện tử (con số này dựa vào kết quả nghiên cứu trên những ti thể độc lập và cũng xem như là tỉ lệ trên cơ thể sống), oxygen bị khử không hoàn toàn và tạo thành gốc superoxide tự do (·O2-), được đề cập đầy đủ ở phức hợp I và phức hợp III. Superoxide không thể tự nó hoạt hóa, nhưng có thể bất hoạt các men đặc hiệu hoặc bắt đầu quá trình lipid peroxidation ở dạng hoạt động của nó, HO2·. pKa của hydroperoxyl là 4.8, vì vậy, trong điều kiện sinh lí bình thường, dạng tồn tại chính của nó là superoxide. 6 Nếu có quá nhiều tổn thương ở ti thể, tế bào sẽ đi vào quá trình tự chết. Protein Bcl2 nằm trên bề mặt của ti thể, phát hiện tổn thương và hoạt hóa một nhóm các protein có tên gọi chung là Bax nằm sâu trong màng ti thể, gây tiết ra chytochrome C. chất này sẽ gắn với Apaf-1, hay apoptotic protease activating factor-1, một chất tự do trong bào tương. Sử dụng năng lượng từ ATP của ti thể, cytochrome C và Apaf-1 kết hợp với nhau tạo thành apoptosome. Apotosome tiếp tục gắn với một protein tự do trong bào tương khác là capase9. Capase-9 sẽ đâm xuyên qua protein màng của ti thể, phá vỡ chúng và bắt đầu chuỗi phản ứng gây biến tính protein và cuối cùng là sự thực bào.(5) ..2. Các loại gốc tự do (RNS): NO• là một phân tử nhỏ có chứa một electron lẻ trên antibonding 2π *y quỹ đạo và, do đó, nó là một gốc tự do. NO• được tạo ra đặc biệt trong các mô sinh học bởi synthases oxit nitric (NOSs), trong đó chuyển hóa arginine thành citrulline với sự hình thành của NO• qua một phản ứng oxy hóa năm electron(6). Nitric oxide (NO•) là một phản ứng cực đoan hoạt động như một phân tử oxy hóa sinh học quan trọng báo hiệu phân tử có trong một lượng lớn các quá trình sinh lý khác nhau, bao gồm cả truyền dẫn thần kinh, điều chỉnh huyết áp, cơ chế bảo vệ, thư giãn cơ trơn và sự điều chỉnh miễn dịch(7). Do tính chất đặc biệt của nó, trong năm 1992, NO• đã được đánh giá là "phân tử của năm" bởi Tạp chí Khoa học(8). NO• có chu kỳ bán rã của chỉ một vài giây trong môi trường nước. NO• có độ ổn định trong môi trường có nồng độ oxy thấp (halflife > 15 s). Tuy nhiên, kể từ khi nó được hòa tan trong dung dịch nước và môi trường lipid, nó dễ dàng khuyếch tán qua các tế bào chất và màng plasma(9). NO• có tác dụng dẫn truyền thần kinh cũng như sự mềm dẻo của khớp thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ương. Trong môi trường ngoại bào, NO• phản ứng với ôxy và nước để tạo thành nitrat và anion nitrit. Việc sản xuất quá mức các loài nitơ phản ứng được gọi là căng thẳng nitrosative(10). Điều này có thể xảy ra khi các thế hệ của các phản ứng loài nitơ trong một hệ thống lớn hơn của hệ thống về khả năng trung hòa và loại bỏ chúng. Căng thẳng Nitrosative có thể dẫn đến các phản ứng nitrosylation làm thay đổi cấu trúc của protein và do đó ức chế chức năng bình thường của protein. 7 Các tế bào của hệ thống miễn dịch sản xuất cả các superoxide anion và oxit nitric trong sự bùng nổ oxy hóa kích hoạt trong suốt quá trình viêm. Theo các điều kiện, oxit nitric và các anion superoxide có thể phản ứng với nhau để tạo ra một lượng đáng kể của một lượng lớn phân tử oxi hóa hoạt động, anion peroxynitrite (ONOO-), đó là một chất oxy hóa mạnh, có thể gây ra sự phân mảnh DNA và oxy hóa lipid(11): NO• + O2•- → ONOOPhản ứng có một trong các hằng số tốc độ cao nhất được biết đến cho phản ứng của • NO , 7.0 × 109M-1 s-1. Như vậy độc tính NO• là chủ yếu liên quan tới khả năng kết hợp với các anion superoxide. Nitric oxide dễ dàng liên kết với một số kim loại chuyển tiếp ion; trong thực tế, nhiều hiệu ứng sinh lý của NO• có tác dụng như là một kết quả của sự liên kết ban đầu với Fe2+ - nhóm Haem trong cyclase enzyme hòa tan guanylate (SGC) (12) Fe2+{sGC} + NO• → Fe2+{sGC}–NO .4. Tác hại của gốc tự do. Các gốc tự do có thể tấn công vào cơ thể vào mọi lúc. Dược sĩ Bruce Ames, Đại học California, đã ước lượng mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta phải hứng chịu khoảng 10.000 gốc tự do tấn công mỗi ngày. Trải qua 70 năm cuộc đời, cơ thể hình thành ước chừng đến 17 tấn gốc tự do. Rất nhiều trong số đó nhắm vào DNA (deoxyribonucleic acid) và các chất liệu di truỵền. Một trong những hậu quả là làm tăng tỷ lệ đột biến. Người già có tỷ lệ đột biến cao gấp 9 lần so với trẻ nhỏ. Chính những những đột biến này làm tăng tỷ lệ ung thư. Thêm vào đó, các gốc tự do có thể gây ra tổn thương cho tất cả các chất liệu và mô trong cơ thể như màng tế bào, protein và mỡ. Mô mỡ là nơi bị tổn thương sớm nhất và thường gặp nhất, vì đó là loại mô rất dễ bị oxy hóa. Các chuyên gia dùng thuật ngữ “sự peroxide hóa Lipid” để mô tả sự oxy hóa của mỡ trong cơ thể. Sự peroxide hóa lipid làm khởi phát một chuỗi phản ứng liên tục trên các chất mỡ và chỉ có thể bị chặn đứng bởi một chất chống oxy hóa. Các gốc tự do còn gây tổn hại cho các acid nucleic cơ bản (adenine, thymine, guanine và cytosine), là những thành phần cơ bản cấu trúc DNA. Tổn thương này làm DNA sao mã không chính xác theo các thông tin sinh học – và tế bào ung thư được hình thành. Gốc tự do còn làm tổn thương protein, dẫn đến sự rối loạn chức năng của nhiều cơ quan trong cơ thể. Ví dụ như, các protein collagen ở da, gây tổn hại da; hay các enzyme (bản chất là protein) bị tổn thương sẽ không hoạt động hiệu quả để xúc tác các phản ứng sinh hóa trong cơ thể. Các enzyme sẽ không được sửa chữa phục hồi vì nồng độ các gốc tự do cao, vòng xoắn bệnh lý này dần dần làm cơ thể lão hóa nhanh hơn và có thể tạo ung thư. Bình thường, tế bào có thể tự chống lại ROS bằng các emzyme như α-1microglobulin, superoxide dismutases, catalases, lactoperoxidases, glutathione peroxidases và peroxiredoxins. Một số phân tử nhỏ như ascorbic acid (vitamin C), tocopherol (vitamin E), uric acid, và glutathione cũng đóng vai trò quan trọng trong chống oxi hóa trong tế bào. Tương tự, chất chống oxy hóa polyphennol cũng giúp chống lại ROS bằng cách thanh lọc các gốc tự do. Ngược lại, khả năng của các chất chống oxi hóa ở ngoại bào lại rất hạn chế, ví dụ chất chống oxi hóa quan trọng nhất trong huyết tương là acid uric. 8 Vai trò của ROS được đề cập đến trong rất nhiều tài liệu, không chỉ liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào mà còn tạo ra các kháng thể trong cơ thể và khởi động các bơm ion. Điều này làm ROS trở thành 1 chất kiểm soát chức năng của tế bào. Đặc biệt, các tiểu cầu tham gia vào việc làm lành vết thương và duy trì cân bằng của máu tiết ra ROS để tạo thêm các tiểu cầu mới tại vị trí vết thương. Chúng cũng nói lên sự liên quan đến các đáp ứng miễn dịch thông qua việc tạo mới thêm các bạch cầu. ROS cũng liên quan đến các hoạt động của tế bào trước mỗi đáp ứng viêm khác nhau, bao gồm cả các bệnh lí tim mạch. Chúng cũng có thể liên quan đến việc suy giảm chức năng nghe thông qua tổn thương ốc tai gây ra bởi tăng tần số âm thanh, trong sử dụng các thuốc gây độc lên tai như cisplatin, và trong tật điếc bẩm sinh ở cả người và động vật. ROS cũng có dính líu đến cơ chế gây chết tế bào theo chương trình cũng như tổn thương thiếu máu cục bộ, ví dụ như đột quỵ và đau tim. Gây tổn thương oxy hóa Ở các sinh vật hiếu khí, năng lượng được tạo thành tại ti thể thông qua chuỗi truyền electron. Để tạo thêm năng lượng, ROS được tạo thành, tuy nhiên đây là chất có khả năng 9 gây tổn thương tế bào, các cấu trúc DNA , RNA, protein và, trên cơ sở lí thuyết, nó góp phần gây nên sự lão hóa. ROS được tạo thành như là 1 sản phẩm của chuyển hóa trong tế bào. Tuy nhiên nó lại là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương, và tác nhân chính thường là H2O2, được tạo thành từ superoxide của ti thể. Catalase và superoxide dismutase có thể làm giảm khả năng gây tổn thương của ROS bằng cách đưa chúng về lại những phân tử cấu thành ban đầu là nước, oxygen và hydrogen. Tuy nhiên, như những phản ứng khác, hiệu suất không bao giờ đạt 100% và phần superoxide dư vẫn tồn tại trong tế bào. Nếu ROS được tạo thành như là 1 sản phẩm chuyển hóa bình thường, thì sự tích tụ 1 lượng lớn có khả năng gây độc. Suy giảm trí nhớ, biểu hiện trong bệnh được tìm thấy ở người cao tuổi – Alzheimer – có liên quan đến sự tích tụ các tổn thương oxi hóa. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự tích tụ ROS gây nên sự lão hóa. Đặc biệt, sự tích tụ các tổn thương oxy hóa có thể gây nên sự suy giảm khả năng nhận thức, lí thuyết này được chứng minh thông qua thí nghiệm trên những con chuột già được tiêm các chất chuyển hóa từ ti thể sau đó kiểm tra về nhận thức của chúng. Kết quả cho thấy nhận thức của chúng cải thiện tốt hơn sau khi được tiêm, gợi ý rằng các chất chuyển hóa làm giảm tổn thương oxi hóa và cải thiện chức năng ti thể. Sự tích tụ các tổn thương oxi hóa làm suy giảm chức năng của ti thể và làm tăng thêm tốc độ sản sinh của ROS trong tế bào. Sự tích tụ các tổn thương oxi hóa và những liên quan đến lão hóa của nó còn tùy thuộc vào từng loại mô khác nhau. Một vài kết quả thí nghiệm khác cho thấy sự tích tụ các tồn thương oxi hóa là nguyên nhân của suy giảm chức năng não theo tuổi. Những con chuột nhảy già thì có hàm lượng protein bị oxi hóa cao hơn những con trẻ. Điều trị những con chuột với hợp chất spin trapping (từ này dịch ra là bẫy quay, nhưng mình chưa nghe thấy bao giờ nên không dám dịch bừa) cho thấy những con chuột già có đáp ứng, đó là sự giảm của nồng độ protein bị oxi hóa trong khi các con chuột trẻ thì lại không. Thêm nữa, những con chuột già có kết quả đo nhận thức tốt hơn và kết quả đó giảm xuống ngay khi dừng điều trị, nồng độ các protein bị oxi hóa tăng trở lại. Kết quả này đưa đến một kết luận rằng sự oxi hóa trong tế bào có liên quan mật thiết đến chưc năng của não bộ (Carney, 1991)(13) Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh vữa xơ động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại. Đôi khi chúng cũng có một vài hành động hữu ích. Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể; tạo ra chất mầu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt. 10 2. Hoạt tính chống oxi hóa .1. Hoạt chất chống oxy hóa ..1. Khái niệm Chất chống oxi hóa là một loại phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác. Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng. Chất chống oxi hóa làm giảm tác dụng của cách quá trình oxi hóa nguy hiểm bằng cách liên kết với nhau với các phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt của chúng. Bất kỳ chất nào ngăn ngừa hay làm chậm sự oxi hóa đều được gọi là chất chống oxi hóa.(14) ..2. Cơ chế của chất chống oxi hóa Chất chống oxi hóa là chất dinh dưỡng, có thể làm sạch các gốc tự do bằng các đưa lên một electron. Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân tử chống oxi hóa, các gốc tự do trở nên ổn định và không còn khả năng gây hại. Ngoài ra, chất chống oxi hóa còn giúp hạn chế sự phân hủy của các hydroperoxide(14) ..3. Phân loại chất chống oxy hóa (antioxidant) (15) Chất chống oxy hóa là một phân tử có khả năng làm chậm hay ngăn ngừa sự oxy hóa những phân tử khác. Oxy hóa là phản ứng giữa một phân tử với oxy, hoặc bất cứ khi nào một phân tử mất một điện tử trong phản ứng hóa học. Những phản ứng oxy hóa có thể sản sinh các gốc tự do và khởi động những phản ứng liên hoàn gây tổn hại tế bào. Các chất chống oxy hóa ngăn chặn các phản ứng liên hoàn này bằng cách tách các gốc tự do và ức chế những phản ứng oxy hóa khác. Chất chống oxy hóa được xếp thành hai nhóm, nhóm hòa tan trong nước và nhóm hòa tan trong lipid. Nói chung nhóm hòa tan trong nước phản ứng với các chất oxy hóa trong tế bào chất, trong huyết tương, trong khi đó nhóm hòa tan trong lipid thì bảo vệ 11 màng tế bào không bị peroxide hóa. Các chất chống oxy hóa có thể được tổng hợp trong cơ thể hay nhận từ thực phẩm. Các chất chống oxy hóa bao gồm: + Vitamin A, D, E, C. + Các coenzyme như coenzyme Q10 (CoQ10) và các chất khoáng dưới dạng các metalloenzyme như superoxide dismutase (SOD) chứa Mn, catalase chứa Fe, glutathion peroxidase chứa Se… + Các carotenoid như α-carotene, β- carotene, lutein, canthaxanthin, zeaxanthin, lycopene… + Các flavonoid polyphenolic như flavone (apigenin, luteolin, tangeritin), flavonol (isohamnetin, kaemferol, quercetin, rutin…), isoflavone phytoestrogen (daizein, genistein, glycitein), các phenolic acid và ester của chúng (acid chicoric, acid cinamic, acid gallic…), các phenolic nonflavonoid (như curcumin, flavonolignan…), các chất chống oxy hóa hữu cơ (như bilirubin, acid citric, acid oxalic…). + Các hormone như melatonin. + Các chất chống oxy hóa tổng hợp như BHT, BHA, Ethoxyquin. Các chất chống oxy hóa thấy trong thực phẩm như vitamin C có nhiều trong rau, quả; vitamin E có nhiều trong dầu thực vật, các polyphenolic acid có nhiều trong trà, café, đỗ tương, dầu olive, chocolate, vang đỏ, quế, các carotenoid có nhiều trong rau quả và trứng… Các chất chống oxy hóa có tác động “hiệp đồng”. Tác động “hiệp đồng” có nghĩa là tác động phối hợp của nhiều chất chất chống oxy hóa, phối hợp lại thì mạnh hơn là ở dạng đơn lẻ. Một cầu thủ siêu sao không tạo nên sức mạnh của cả đội bóng. Như vậy dùng phối hợp nhiều loại thực phẩm trong bữa ăn, đặc biệt sử dụng nhiều loại rau quả có tác dụng cung cấp nhiều loại chất chống oxy hóa khác nhau. (Các gia vị như hạt tiêu, ớt, nghệ, tỏi… hay thảo dược như húng, thì là, kinh giới…cũng giầu các chất chống oxy hóa, nhưng số lượng dùng trong bữa ăn rất ít cho nên không phát huy được tác dụng). Các chất chống oxy hóa có vai trò quét các gốc tự do bắn phá tế bào, nhờ đó ngăn chặn được sự tổn hại của tế bào. Để minh họa cho cơ chế này hãy xem các phản ứng trung hòa gốc tự do peroxide (H2O2) của enzyme superoxide peroxidase (SODs) catalase và glutathion peroxidase (GPx): SODs xúc tác phân giải anion superoxide thành oxy và hydrogen peroxide (H2O2), catalase xúc tác phân giải H2O2 thành nước và oxy, GPx cũng phân giải H2O2 thành nước (có hai loại superoxide dismutase, một trong ty thể chứa Mn, một trong tế bào chất chứa Cu và Zn; catalase chứa Fe và glutathione peroxidase chứa Se; các nguyên tố Fe, Cu, Mn, Zn, Se đến từ bữa ăn). Superoxide dismutase 2O-2 + 2H H2O2 + O2 Catalase H2O2 2H2O + O2 Glutathione peroxidase 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O 12 Nhờ hoạt động của hệ thống các chất chống oxy hóa trong cơ thể mà nhiều bệnh tật được ngăn ngừa như bệnh tim mạch (xơ vữa động mạch, suy tim, nhồi máu cơ tim, cao huyết áp...), các bệnh ung thư, các bệnh về mắt (thoái hóa hoàng điểm và đục thủy tinh thể), lão hóa... (15) ..4. Phân loại chất chống oxi hóa trong thực phẩm Hiện nay các chất chống oxi hóa được sử dụng trong hàng ngàn loại thực phẩm khác nhau. Các chất chống oxi hóa thực phẩm dựa trên hai dạng cơ bản sau: + Các chất chống oxi hóa có bản chất acid (bao gồm cả các muối và ester của chúng). Ví dụ: acid ascorbic, acid citric... + Các hợp chất gốc phenolic (cả tự nhiên lẫn tổng hợp). Ví dụ: BHA, tocopherol... (15) .2. Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa ..1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH(16,17,18,19,20) Nguyên tắc: Các chất có khả năng kháng oxy hoá sẽ trung hoà gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cự đại và màu của dung dịnh phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phương trình phản ứng : Cách tính kết quả: Cách 1: Hoạt tính sàng lọc gốc tự do được tính theo phương trình sau: 1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH(%) = 13 Asample (30 phút )  Ablank ( 30 phút )    Acontrol ( 0 phút )   x100 Acontrol (30 phút )   (  Asample (30 phút )  Ablank (30 phút )  1   x100 Acontrol (30 phút )   Acontrol(0 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng ngay sau khi pha chế. Acontrol(30 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng sau 30 phút ủ. Asample(30 phút) = độ hấp thu của mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ. Ablank(30 phút) = độ hấp thu của mẫu trắng sau 30 phút ủ. Lượng mẫu cần thiết để phản ứng với một nửa lượng DPPH (hay độ hấp thu 50%) được gọi là lượng tương đối Trolox phản ứng. Khi đó, hoạt tính chống oxi hóa của mẫu có thể diễn tả bằng thuật ngữ là số micromole bằng Trolox/100g mẫu hay đơn vị Trolox/100g hay TE/100g. (TE: trolox equivalent) hay IC50. (17) Cách 2: Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau : DPPH (%) = 100 × (ACT - ASP)/ACT. Trong đó: ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết. ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết. Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Cách 3: Khả năng chốngoxy hóa căn bản DPPH đã được tính toán bằng cách sử dụng phương trình sau đây: Ảnh hưởng chống oxy (%) = [1 - (Amẫu– Amẫu rỗng) / Akiểm soát] x 100 Ta có A kiểm soát là độ hấp thụ của các chất kiểm soát (dung dịch DPPH không mẫu),A mẫu là độ hấp thụ của mẫu thử nghiệm (DPPH dung dịch cộng với mẫu thử), và A mẫu rỗng là độ hấpthụ của mẫu (mẫu mà không có dung dịch DPPH) Cách 4: % ức chế gốc DPPH của các mẫu thực vật được tính toán theo công thức của Yen và Dul (1994) : % Ức chế DPPH = [(AC(0) – AA(t))/AC(0)]x100 AC(0) là độ hấp thu của dung dịch DPPH ở thời điểm t = 0 phút AA (t) là độ hấp thu của mẫu thử nghiệm ở thời t = 16 min. Để xác định giá trị IC50, mỗi mẫu thử được pha thành 6 nồng độ: 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml và 0,03125 mg/ml. Giá trị IC50 của các mẫu được tính bởi phương pháp hồi qui tuyến tính của đồ thị biểu diễn phần trăm loại gốc tự do DPPH tương ứng với mỗi nồng độ của mẫu thử a. Chuẩn bị dịch chiết và hóa chất Hóa chất: Dung dịnh DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ). Dịch chiết: Khi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau thì có lượng mẫu khác nhau, trung bình từ 1,5 -2 kg. Từ nguồn mẫu lớn lấy ngẫu nhiên 3 mẫu nhỏ từ nguyên liệu. Quá trình chiết được thực hiện trên mỗi mẫu nhỏ, dịch chiết từ mỗi mẫu nhỏ được phân tích lặp lại ít nhất 2 – 3 lần. Kết quả báo cáo cuối cùng là giá trị trung bình từ các mẫu nhỏ dùng để đánh giá kết quả cho mẫu lớn . Trong quá trình chiết, nước được sử dụng làm dung môi chiết với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/15 (w/v). Nhiệt độ và thời 14 gian chiết là 90C và 30 phút. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt ( Elma, S 300H, Elmasonic, Germary). Dịch lọc trong thu được sau quá trình ly tâm ở 4C, tốc độ 5.000 rpm trong 15 phút ( Centrifuge, Labentech, Mega 17R, Germary ). b. Cách tiến hành Khoảng 20µl đến 140µl dịch chiết trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3ml. Sau đó thêm 1ml dung dịch DPPH 0,2mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). c. Quy trình Ưu điểm, hạn chế và tính ổn định của phương pháp DPPH a. Tính ổn định DPPH là một phương pháp nhanh chóng, đơn giản, không tốn kém, sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng của các hợp chất để hoạt và để đánh giá hoạt động chống oxy hóa của thực phẩm. Nó cũng có thể được sử dụng để định lượng chất chống oxy hóa trong các hệ thống sinh học phức tạp, cho mẫu rắn hoặc lỏng. Phương pháp này rất dễ dàng và áp dụng để đo lường khả năng chống oxy hóa tổng thể và các hoạt động nhặt rác gốc tự do của trái cây và nước rau ép. Phương pháp này là duy nhất trong việc thực hiện các phản ứng của các mẫu với DPPH trong methanol / nước, tạo điều kiện khai thác của các hợp chất chống oxy hóa từ mẫu. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các loại thực phẩm sử dụng DPPH được so sánh với các phương pháp khác. Phân tích chất chống oxy hóa bằng các phương pháp khác có thể được giới hạn ở những hợp chất hòa tan trong các dung môi được lựa chọn. b. Ưu điểm DPPH được phép phản ứng với toàn bộ mẫu và đủ thời gian nhất định trong phương pháp này cho phép DPPH để phản ứng chậm ngay cả với chất chống oxy hóa yếu . 15 DPPH có thể được sử dụng trong các dung môi hữu cơ và dung dịch nước không phân cực và có thể được sử dụng để kiểm tra cả hai chất chống oxy hóa ưa nước và ưa mỡ. Có độ chính xác cao , dễ dàng và kinh tế có giá trị để đánh giá hoạt động nhặt rác triệt để các chất chống oxy hóa, vì các hợp chất cơ bản là ổn định và không cần phải được tạo ra. c. Hạn chế Do DPPH tương tác cơ bản với các gốc khác và đường cong đáp ứng thời gian để đạt được trạng thái ổn định không tuyến tính với tỷ lệ khác nhau của các chất chống oxy hóa / DPPH (Brand-Williams et al 1995;. Sanchez-Moreno et al 1998.). DPPH là nhạy cảm với một số căn cứ Lewis và các loại dung môi cũng như oxy. DPPH chỉ có thể được hòa tan trong dung môi hữu cơ và sự can thiệp của hấp thụ từ các hợp chất mẫu có thể là một vấn đề đối với các phân tích định lượng . Độ hấp thụ của DPPH trong methanol và acetone giảm dưới ánh sáng Phương pháp DPPH có những hạn chế trong việc phản ánh các phân vùng của chất chống oxy hóa trong các hệ thống nhũ tương và không phải là hữu ích để đo lường các hoạt động chống oxy hóa của huyết tương, bởi vì protein được kết tủa trong môi trường phản ứng có cồn. ..2. Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự do NO(19,21) Hóa chất – dụng cụ Dung dịch natri nitroprussid 10 mM: pha trong đệm phosphat pH 7.4 (20 mM) trước khi tiến hành thí nghiệm và được bảo quản trong chai tối màu. Thuốc thử Greiss :bao gồm 2 dung dịch A và B: + Dung dịch A: sulfanilamide 2% trong acid phosphoric (H3PO4) 4%. + Dung dịch B: N-(1-napthyl)-ethylendiamin 0.2% trong nước cất. Hai dung dịch này được trộn với cùng tỉ lệ thể tích trước khi thí nghiệm. Quercetin và các hợp chất thử nghiệm được cô lập từ hoa cúc trắng, độ tinh khiết của các chất này được xác định theo phương pháp HPLC. Máy UV-Vis. Cơ sở phương pháp Natri nitroprussid bị phân hủy dưới ánh sáng sinh ra gốc tự do NO. Trong dung dịch nước, NO sinh ra sẽ phản ứng với oxy tạo thành sản phẩm bền vững là nitrit và nitrat. Khi mẫu có hoạt chất ức chế NO, thì hoạt chất sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả làm giảm nồng độ nitrit tạo thành trong dung dịch. Dựa trên sự giảm hàm lượng nitrit tạo thành của mẫu có hoạt chất ức chế NO so với mẫu không có hoạt chất ức chế NO (mẫu control), ta tính được khả năng ức chế gốc tự do NO của hoạt chất. Hàm lượng nitrit tạo thành được xác định dựa trên phản ứng lên màu với thuốc thử Greiss tại bước sóng 540 nm. Khả năng ức chế gốc tự do NO được xác định dựa trên phần trăm ức chế I (%). Từ đó, ta tính được giá trị IC50, đại lượng đánh giá khả năng ức chế mạnh hay yếu của các hoạt chất, IC50 (Inhibitory concentration) được định nghĩa là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể 16 ức chế được 50% gốc tự do NO. Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát, chúng ta sử dụng quercetin và acid caffeic làm chất đối chứng để so sánh, vì đây là những chất có hoạt tính mạnh đối với gốc tự do NO được sử dụng làm chất đối chứng trong các tài liệu tham khảo. Chuẩn bị mẫu Hoa cúc trắng khô (2.3kg) được trích hoàn lưu bằng methanol (MeOH) trong 3h. Sau khi cô quay, cao methanol (500g) được chiết lần lượt với hexan (127g), chloroform (21g), etylacetat (44g), butanol (88g) và nước (200g). Lấy 18g cao CHCl3 cao EtOAc chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi MeOH-CHCl3 và thu được 7 phân đoạn. Tiếp tục sử dụng sắc ký cột và sắc ký bản mỏng điều chế các phân đoạn này thu được 28g hợp chất tinh khiết, chia thành 3 nhóm chính là: nhóm flavonoid (1-15), nhóm dẫn xuất của acid caffeoylquinic (16-22) và nhóm các phenol đơn giản (23-28). Công thức của các hợp chất được trình bày như sau: Mẫu cao và chất được hòa tan trong hỗn hợp dung dịch đệm phosphat pH 7.4 – etanol, nồng độ etanol cuối cùng khoảng 2%. Mỗi mẫu được thử ở 4 nồng độ khác nhau, trong đó: + Mẫu cao metanol: 200, 100, 50 và 25 (g/mL + Mẫu chất: 100, 50, 25, 10 (M. 17 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO ..3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) (22,27) Cấu tạo Enzyme XO: Là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có phân tử lượng là 300000 Da, trong đó mỗi monomer của protein tổ chức gồm 3 phần (domain) chính: một phần chứa 2 tâm Fe2S2, một phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là molybdopterin, một phần là flavinadenine dinucleotide (FAD). Trong đó phần chứa Mo là phần lớn nhất và là trung tâm hoạt tính xúc tác của enzyme, tâm Fe2S2 và FAD đóng vai trò là những chất vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa được xúc tác bởi enzyme. Cơ chế hoạt động của enzyme XO: Enzyme XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase). Enzyme XO xúc tác cho sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát: Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi màu xanthine thành acid uric Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO: 18 Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O2●. Acid uric có bước sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Nếu mẫu thử có khả năng kháng enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm giá trị mật độ quang Phản ứng tạo acid uric Các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng được sử dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng như kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này được gọi là các chất kháng oxy hóa. Chúng có thể đƣợc sinh ra từ cơ thể như hệ thống kháng oxy hóa có bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và những chất kháng oxy hóa có phân tử lượng thấp như glutathinon, vitamin E, vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả như các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin... Phương pháp được xác định theo Noro và cộng sự (1983) • Thuốc thử: Đệm phosphat 70 mM (pH=7,5), xanthin oxidase 0,08 U/ml, xanthin 150 µmol, HCl 1N. • Tiến hành: Hỗn hợp gồm 300 µl dung dịch mẫu, 1500 µl đệm phosphate 70 mM và 100 µl xanthin oxidase 0,08 U/ml được đem đi ủ trong 15 phút ở 250C. Sau đó dung dịch này được thêm vào 900 µl dung dịch xanthin 150 µmol vào và tiếp tục được ủ trong 30 phút. Sau đó phản ứng được kết thúc bằng HCl 1N và được đo mật độ đo quang ở bước sóng 290 nm. Tính toán : Khả năng ức chế Khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của mẫu thử được tính bằng công thức: I (%) = [(Ac-As)/Ac] *100 Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu thử As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có mẫu thử 19 ..4. Phương pháp đo MDA (23,24) MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào. Nguyên tắc MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm, phản ứng được thực hiện ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100 độ C trong thời gian từ 10 đến 15 phút. Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính được khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu (3,5). Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau Cơ chế phản ứng màu của MDA và acid thiobarbituric Phương pháp được thực hiện theo Bagaladorov và cộng sự (1987) • Thuốc thử: Tween 80 (1%), FeSO4 (10-3 M), acid ascorbic (10-2 M), acid trichloracetic (30%). acid thiobarbituric 0,25%. • Tiến hành: Hỗn hợp dung dịch gồm 2 ml of Tween 80 (1%), 0,2 ml FeSO4 (10-3 M), 0,2 ml acid ascorbic (10-2 M) và 0,2 ml mẫu được trộn đều, sau đó mang đi ủ ở 40oC trong tối trong thời gian 48 giờ. Kết thúc phản ứng peroxid hóa lipid bằng cách thêm 1,3ml acid trichloracetic (30%). Hỗn hợp này cũng được trộn đều và được ủ trong thời gian 1 giờ. Sau đó, dung dịch này được ly tâm ở tốc độ 600 vòng/phút trong thời gian 10 phút. 2 ml dịch nổi được hút vào ống nghiệm nhỏ và được thêm vào 2 ml acid thiobarbituric 0,25%. Ống nghiệm này được đặt vào nước sôi khoảng 15 phút, để nguội, sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 532 nm. Tất cả các mẫu được thực hiện lặp lại 3 lần. • Tính toán Phần trăm ức chế sự peroxid hóa lipid của mẫu thử được tính theo công thức % ức chế = [(X– Y )/X)]x100 Với X là độ hấp thu của mẫu chứng (không có mẫu thử) Y độ hấp thu của dung dịch phản ứng có mẫu thử nghiệm 20